Возможность определения пирогенных примесей в воде для инъекций люминесцентным методом

Н. В. Глазова, В. Л. Багирова, А. А. Крашенинников, А. В. Караваева,
Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия, НПФ «Люмекс», Институт стандартизации лекарственных средств

Основным источником пирогенных примесей в воде для инъекций является комплекс эндотоксина с белком грамотрицательных бактерий, который входит в состав наружной мембраны клеток [1]. Отделение связанного белка возможно лишь при наличии щелочей или фенола, что маловероятно в воде для инъекций. Поэтому в дальнейшем под термином «бактериальные эндотоксины в воде для инъекций» понимается липополисахаридобелковый комплекс.

До недавнего времени фармакопеями многих стран для испытания на пирогенность использовались кролики. Однако фармакологический тест опре­деления пирогенности на кроликах является качественным, т. е. запрещающим или разрешающим. Кроме того, результаты теста зависят от индивидуальных особенностей животных, их состояния. Не все лекарственные сред­ства могут быть тестированы с помощью данного метода [2].

Одним из активно развивающихся в настоящее время способов контроля пирогенности лекарственных препаратов, который вошел в фармакопеи многих стран, в том числе и России, является ЛАЛ-тест. В основе метода лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста Limulus polyphemus специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий — липополисахаридами. При взаимодей­ствии эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля (тромбообразование), что и служит индикатором присутствия эндотоксина в реакционной смеси.

Тест высокоспецифичен по отношению к эндотоксинам грамотрицательных бактерий. Чувствительность его во много раз превышает чувствительность фармакопейного теста на кроликах (табл. 1).

ЛАЛ-тест имеет широкий спектр применения: контроль качества воды, парентеральных лекарственных средств, инъекционных и инфузионных растворов и медицинских изделий, в которых определение уровня бактериальных эндотоксинов предписано дей­ствующими нормативными документами, для оценки качества валидации в фармацевтической промышленности. Этот тест может быть использован и для оценки санитарного состояния питьевой воды и косвенного определения содержания в ней бактерий. К настоящему времени ЛАЛ-тест прочно внедрен в практику производства и контроля лекарственных средств на ведущих фармацевтических фирмах мира. Несмотря на высокую чувствительность ЛАЛ-теста, он, тем не менее, не является экспресс-методом. Кроме того, тест также имеет некоторые ограничения. В отличие от пирогенного теста на кроликах, выявляющего пирогены широкого спектра, ЛАЛ-тест позволяет выявить только бактериальные эндотоксины — высокомолекулярные комплексы, являющиеся структурными компонентами внешней клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

В связи с развитием люминесцентных методов анализа и появлением на рынке России приборов, измеряющих люминесценцию (например, Флюорат02 АВФФ-ДХ), перспективной является разработка люминесцентного экспресс-метода определения пирогенности, который удобен для использования в условиях аптеки и на различных стадиях контроля воды для инъекций. В основе метода определения пирогенности воды для инъекций лежит измерение интенсивности люминесценции в присутствии липополисахаридобелкового комплекса (примесей). Интенсивность люминесценции регистрируется при помощи анализатора биожидкостей типа Флюорат-02. В состав набора для анализа входит контрольный люминесцентный стандарт (КЛС), который должен быть предварительно откалиброван по эталонному люминесцентному стандарту (ЭЛС), который хранится у изготовителя.

Для установления порогового значения интенсивности люминесценции, которое определяет положительный или отрицательный результат на наличие пирогенных примесей в анализируемой воде для инъекций, мы проводили параллельное определение пирогенности на кроликах, определяли концентрацию бактериальных эндотоксинов по ЛАЛ-тесту и одновременно проводили измерение показателя люминесценции на приборе Флюорат-02.

Испытания на пирогенность на кроликах проводилось согласно ГФ XI, с. 186. Концентрацию бактериальных эндотоксинов проводили по ЛАЛ-тесту двумя способами: качественным гель-тромб-тестом согласно ОФС 42-002-00 [3] и количественным колориметрическим методом [1, 4].

Для проведения ЛАЛ-теста использовались реактивы производства «Charles River Endosafe» Inc (США) (регистрационное свидетельство МЗ РФ № 99/113 от 18.08.99), поставляемые в Россию фирмой «Тандра».

В работе использовался ЛАЛ-реагент чувствительностью 0,125 ЕДэ/мл (lot # L2061L) и 0,003 ЕДэ/мл (lot # L3111L), контрольный стандарт эндотоксина (0,5 мкг во фл.), оттитрованный по RSE (FDA) (lot # ES-6), вода для анализа по ЛАЛ-тесту (lot #P01411).

Качественный анализ содержания бактериальных эндотоксинов проводили в соответствии с ОФС 42-0002-00 [3]. Количественный анализ проводили колориметрическим методом [1, 4].

Таблица 1

Расчет среднего геометрического значения интенсивности люминесценции в испытуемой пробе

In*	Е
0,181	- 0,74
0,142	- 0,85
0,158	- 0,80
0,141	- 0,85
	- 0,795
	0,160

*In — среднее арифметическое значение интенсивности люминесценции по результатам четырех повторных измерений одной пробы

Таблица 2

Сравнительный анализ воды для инъекций на пирогенность различными методами на базе ОТК ООО «Самсон-Мед»

* — нормированная интенсивность люминесценции (In) представляет собой отношение интенсивности люминесценции пробы (Ii) к интенсивности люминесценции контрольного люминесцентного стандарта (Iо).
Н/д — не делали

Таблица 3

Результаты определения пирогенности воды для инъекций различными методами в средней пробе* на базе ОТК ООО «Самсон-мед»

* — за среднюю пробу принята проба (не менее 500 мл), полученная смешением в асептических условиях шести разовых проб, отбираемых через каждые четыре часа из емкости через нижний штуцер под факелом;
** — за серию принято любое количество воды для инъекций, произведенное за единый промежуток времени (сутки) на одном оборудовании (осмотическая установка, дистиллятор).

В таблице 2 и 3 представлены данные анализа по трем методам серий образцов проб воды для инъекций, произведенных на ООО «Самсон-Мед». Следует отметить, что время проведения анализа на приборе Флюорат-02 занимало не более 5 минут, а на кроликах и по ЛАЛ-тесту — не менее 3х часов.

Как видно из таблиц 2 и 3, наблюдается корреляция (коэффициент корреляции r = 0,989, стандартная ошибка S = 0,0399 по программе CURVE EXPERT 1.3) между показателями нормированной интенсивности люминесценции (In) и концентрацией эндотоксина. По результатам таблицы 1 для удобства пользования был построен график зависимости In от концентрации эндотоксина (рис. 1), по которому можно рассчитать показатель In, соответствующий предельно допустимому содержанию бактериальных эндотоксинов в воде для инъекций, указанной в Фармакопеях США и РФ — 0,25 ЕЭ/мл [5, 6]. По графику это соответствует значению In равному 0,135. Кроме того, данное значение In можно рассчитать не используя график, а по среднегеометрическому значению логарифмов результатов, полученных по результатам измерений четырех повторностей (см. пример расчета ниже).

Пример расчета

Для определения значения интенсивности люминесценции в испытуемой пробе рассчитывают его среднее геометрическое значение, которое представляет собой антилогарифм среднего значения логарифмов результатов, полученных в каждой из четырех повторностей проб, отобранных из одной емкости.

Расчет производится по формуле:

Среднее геометрическое значение

где: — логарифм значения интенсивности люминесценции в каждой повторности,
— сумма логарифмов значений интенсивности люминесценции,
— количество повторностей.

Результат испытания в каждой пробе интерпретируется при In > 0,135 как положительный (пирогенная вода), при In < 0,135 как отрицательный (апирогенная вода).

Пример расчета представлен в таблице 1.

В данном примере результат положительный — испытуемая вода для инъекций не удовлетворяет требованию по пирогенности, так как эта величина превышает значение 0,135.

Проведенная валидация различных методов определения пирогенности с высоким коэффициентом корреляции (r = 0,989) позволяет рекомендовать люминесцентный метод как альтернативный для введения в ФС, а, кроме того, он может самостоятельно использоваться для анализа воды в аптеках и на различных стадиях технологического процесса получения воды для инъекций.

Литература

1. Ситников А. Г., Глазова Н. В., Трави­на Л. А., Багирова В. Л. ЛАЛ-тест. Современные подходы к определению пирогенности.— СПб., 1994.— 105 с.
2. Крылов Ю. Ф., Кивман Г. Я. Биологический контроль безопасности лекарственных средств.— М.: Медицина, 1985.
3. ОФС 42-0002-00 «Бактериальные эндотоксины».
4. Nandan R., Brown D. R.//J. Lab. Clin. Med.— 1977.— Vol. 89.— P. 910-918.
5. The United States Pharmacopeia/The National Formular 2000.
6. ФС 42-2620-97 «Вода для инъекций», изменение № 1, 31 мая 2000 г.