Логотип журнала "Провизор"








Лечение медикаментозного гепатита у крыс с помощью трансплантации стромальных клеток костного мозга

Е. А. Щегельская, С. О. Гурина, Ю. Е. Микулинский, лаборатория молекулярной диагностики и клеточных биотехнологий ООО «Вирола», г. Харьков

Введение

Многочисленные данные о гепатотоксическом действии многих лекарственных препаратов свидетельствуют о том, что медикаментозные поражения печени — одна из важнейших проблем гепатологии. Все большее беспокойство вызывают лекарственные гепатиты. К числу медикаментозных средств, способных вызывать тяжелые поражения печени, относятся даже такие широко распространенные препараты, как парацетамол. Особенно опасны передозировка парацетамола или его прием на фоне хронического потребления алкоголя, приводящего к активации ферментов, принимающих участие в метаболизме препарата, и к увеличению образования биологически активных радикалов, вызывающих повреждение печени. Тяжелые гепатотоксические реакции описаны и у людей, часто принимающих спиртные напитки в небольших количествах на фоне приема относительно невысоких доз парацетамола — 2,6 г/сут. [1]. Парацетамол является одной из основных причин развития тяжелых гепатотоксических реакций у детей, причем исследования показывают, что в ряде случаев они развиваются на фоне приема значительно меньшей разовой дозы препарата, чем установленный порог токсичности — 120–150 мг/кг.

Для разработки современных подходов к лечению заболеваний печени в настоящее время активно применяют результаты исследований в области клеточной биологии, в частности данные о дифференцировке стволовых клеток разных типов в гепатоциты.

Одним из источников клетокпредшественников гепатоцитов могут служить клетки крови пупочного канатика человека (ККПК). Эксперименты по дифференцировке ККПК в гепатоциты дали положительный результат, что было подтверждено рядом соответствующиханализов. Для дифференцировки in vitro опытным путем был подобран оптимальный набор ростовых факторов и факторов дифференцировки (FGF-1, FGF-2, LIF, SCF и HGF), приводящий к появлению на 21-й день культивирования наибольшего числа овальных клеток, прикрепленных к культуральной чашке и экспрессирующих мРНК альбумина. Экспрессия маркеров, характерных для гепатоцитов (GS, ЦК-18 и αFP), была подтверждена RT-PCR и иммунофлюоресцентным анализом [2].

Имеются некоторые данные о том, что клетки костного мозга также могут дифференцироваться в гепатоциты. Промежуточной стадией являются овальные клетки, которые, дифференцируясь в гепатоциты, начинают экспрессировать специфические для них белки [3]. Американские исследователи трансплантировали клетки костного мозга от самцов самкам мышей с поврежденной печенью. Клетки доноров дифференцировались в гепатоциты в печени реципиентов и были обнаружены по наличию в них Y-хромосомы [4].

Возможность дифференцировки мезенхимальных (стромальных) клеток костного мозга в гепатоциты под действием разных ростовых факоров была также показана in vitro. Выделенные мультипотентные мезенхимальные клетки человека, мыши и крысы культивировали с факторами роста и дифференцировки FGF-4 и HGF, в результате чего они дифференцировались в эпителиоподобные клетки, экспрессирующие ядерный фактор гепатоцитов3β (HNF-3β), GATA-4, цитокератин 19 (ЦК19), α-фетопротенин (αFP) на 7-й день и ЦК18, HNF-4 и HNF-12 на 14–28 дни. От 5% (грызуны) до 25% (человек) клеток были двуядерными на 21 день индукции. Эти клетки также приобретали функциональные характеристики гепатоцитов: они секретировали мочевину, альбумин, экспрессировали цитохром Р450, могли запасать гликоген [5]. В одной из наших работ также было показано, что стромальные клетки костного мозга (СККМ) мышей под действием факторов кондиционной среды, полученной на культуре клеток эмбриональной печени мышей, могут дифференцироваться в клетки-предшественники гепатоцитов [6].

При совместном культивировании гепатоцитов и СККМ было обнаружено усиление пролиферации и дифференцировки в культуре гепатоцитов крыс, увеличение количества колоний предшественников гепатоцитов. При использовании культур с полупроницаемыми мембранами было установлено, что для стимуляции клеточной пролиферации необходим прямой межклеточный контакт. В совместных культурах было показано увеличение экспрессии и активности специфических транскрипционных факторов печени, протеинов и ферментов, таких как триптофан-2,3-диоксигеназа [7]. Таким образом, СККМ, по-видимому, не только сами могут дифференцироваться в гепатоциты под дей-ствием специфического микроокружения, но способны также активно стимулировать дифференцировку и пролиферацию стволовых клеток печени и предшественников гепатоцитов. Поэтому использование недифференцированных СККМ для восстановления и стимуляции репаративных механизмов при повреждении печени может быть оправданно.

Целью данной работы было изучение возможности лечения медикаментозного гепатита у крыс, вызванного высокими дозами парацетамола, с помощью трансплантации недифференцированных СККМ.

Материал и методы

Модель медикаментозного гепатита получали на 12 крысах путем введения в желудок парацетамола в дозе 1250 мг/кг раз в сутки в виде суспензии в 2% растворе крахмального геля в течение двух суток. Результатом передозировки парацетамола является тяжелое повреждение паренхимы печени, вызванное некрозом в центральных и средних отделах печеночных долей уже через 24 часа после его введения в токсичных дозах.

Культуру стромальных клеток костного мозга (СККМ) крыс получали из костного мозга. Костный мозг выделяли из берцовых костей крыс, промывая их раствором Хэнкса. Ткань ресуспендировали, после чего полученные клетки дважды отмывали в растворе Хэнкса, центрифугируя их в течение 10 мин. при 1200 об./ мин. Отмытые клетки ресуспендировали в смеси культуральных сред DMEM и F12 (1:1) (Sigma, США) с 10% фетальной бычьей сывороткой (Sigma, США) и 50 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения). Клетки рассеивали в культуральные сосуды площадью 80 см2 (Nunc, США) и культивировали при 37 °С в атмосфере 5% CO2 в СО2-инкубаторе. Через 24 часа среду с неприкрепившимися к субстрату кроветворными клетками костного мозга удаляли, добавляли свежую порцию среды и продолжали культивировать оставшиеся прикрепленными фибробластоподобные клетки стромы в течение еще 12 суток, меняя среду каждые 3 суток.

Трансплантацию СККМ проводили через 20 часов после последнего введения парацетамола. Суспензию СККМ (300 тыс. клеток) вводили крысам в хвостовую вену.

Биохимическое состояние печени оценивали до и после введения парацетамола, а также через 7 суток после введения суспензии клеток стромы костного мозга. Кровь забирали из хвостовой вены крыс. Сыворотку получали путем центрифугирования крови в течение 10 мин при 1500 об/мин. Биохимическими критериями оценки служили каталитическая концентрация щелочной фосфатазы (ЩФ), аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ), тимоловая проба и уровень альбумина в сыворотке крови.

Гистологический анализ состояния печени крыс из опытной и контрольной групп проводили в конце эксперимента. Для этого кусочки печени фиксировали в 10% растворе формалина, заливали в парафиновые блоки, из которых делали препараты, окрашенные гематоксилин-эозином.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты оценки биохимического состояния печени показали, что через 18 часов после последнего введения парацетамола происходит увеличение каталитической концентрации АлАТ в два раза, а также значительное увеличение концентрации АсАТ. Повышение активности АлАТ и АсАТ говорит о нарушении целостности гепатоцитов, т. к. эти ферменты локализованы в цитоплазме клеток печеночной паренхимы и при некротическом изменении печени выходят в кровь. Увеличение тимоловой пробы в сыворотке крови более чем в два раза свидетельствует о появлении воспалительного процесса, сопровождающего поражения паренхимы печени. Каталитическая концентрация ЩФ возрастала незначительно, а уровень альбумина оставался в пределах нормы. Через неделю после введения парацетамола в контрольной группе каталитическая концентрация АлАТ незначительно снизилась, а концентрация АсАТ и уровень тимоловой пробы остались повышенными. В опытной группе крыс через семь дней после введения СККМ каталитическая концентрация АлАТ, АсАТ и тимоловая проба в сыворотке крови снизились до нормы (рис. 1–3), что свидетельствует о восстановлении белковой и ферментативной функций печени, а также о снижении воспалительного процесса. Снижение активности АсАТ и АлАТ может свидетельствовать о восстановлении паренхимы печени.

Каталитическая концентрация аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови крыс с моделью медикаментозного гепатита после введения СККМ

Рисунок 1 : : Каталитическая концентрация аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови крыс с моделью медикаментозного гепатита после введения СККМ

Каталитическая концентрация аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в сыворотке крови крыс с моделью медикаментозного гепатита после введения СККМ

Каталитическая концентрация аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в сыворотке крови крыс с моделью медикаментозного гепатита после введения СККМ

Тимоловая проба в сыворотке крови (Тим) крыс с моделью медикаментозного гепатита после введения СККМ

Тимоловая проба в сыворотке крови (Тим) крыс с моделью медикаментозного гепатита после введения СККМ

На гистологических препаратах печени крыс контрольной группы через неделю после последнего введения парацетамола были обнаружены обширные зоны с признаками некроза, представленные гепатоцитами с темными ядрами и бледной вакуолизированной цитоплазмой. Часто встречались участки с полностью разрушенными клетками (рис. 4). В печени крыс опытной группы через неделю после внутривенной трансплантации СККМ островки некроза были меньше и встречались значительно реже, цитоплазма клеток была менее вакуолизирована, паренхима печени во многих местах имела нормальный вид. Между гепатоцитами, особенно в зонах с поврежденными клетками, было много мелких клеток, похожих на лейкоциты, и, возможно, стромальные клетки (рис. 5). Вероятно, трансплантация СККМ ускоряет прохождение воспалительного процесса в печени.

Паренхима печени крыс контрольной группы через 7 суток после повреждения парацетамолом

Рисунок 4 : : Паренхима печени крыс контрольной группы через 7 суток после повреждения парацетамолом

Рисунок 5 : : Паренхима печени опытной группы крыс через 7 суток после повреждения парацетамолом и трансплантации СККМ

Рисунок 5 : : Паренхима печени опытной группы крыс через 7 суток после повреждения парацетамолом и трансплантации СККМ

Наши данные согласуются с результатами, полученными в некоторых опытах по трансплантации стволовых клеток костного мозга крысам с различными типами повреждения печени. Так, показано, что гематопоэтические стволовые клетки дифференцируются в гепатоциты in vivo после их внутривенного введения мышам с моделью наследственной тирозинемии типа I, что приводит к выздоровлению мышей и восстановлению биохимической функции их печени [8]. В другой работе показана дифференцировка клеток костного мозга самцов в зрелые клетки печени после их введения в хвостовую вену летально облученных самок мышей. Доказательством стало наличие Y-хромосомы в гепатоцитах самок [9].

Таким образом, трансплантация СККМ крысам с медикаментозным гепатитом, вызванным высокими дозами парацетамола, стимулирует регенеративные процессы в печени и приводит к более быстрому восстановлению некоторых ее функций. Мы не можем однозначно утверждать, дифференцируются ли трансплантированные СККМ в гепатоциты или же стимулируют собственные стволовые клетки печени к пролиферации и дифференцировке. Но полученные данные обнадеживают и позволяют надеяться, что после проведения клинических исследований трансплантации аутологичных СККМ могут быть использованы для лечения заболеваний печени, вызванных передозировкой лекарственных препаратов.

( Л И Т Е Р А Т У Р А )

(1) Хазанов А. И. К вопросу об алкогольных поражениях печени // Рос. мед. вести.— 1998.— № 1.— С. 40–44.

(2) Kakinuma S., Tanaka Y., Chinzei R., Watanabe M., Shimizu-saito K., Hara Y., Teramoto K., Arii S., Sato C., Takase K., Yasumizu T., Teraoka H. Human Umbilical Cord Blood as a Source of Transplantable Hepatic Progenitor Cells // Stem Cells.— 2003.— V. 21.— P. 217–227.

Полный список литературы — на сайте http://www.provisor.com.ua






© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика