Логотип журнала "Провизор"








Удачи и поражения соперников Природы

«Клон (от гр. klon — «ветвь, отпрыск») — популяция клеток или организмов,
происшедших путем бесполого размножения.»
Советский энциклопедический словарь, 1987

От амфибий к овечке Долли

Все клетки организма — неважно,растительный это организм или организм животного — имеют совершенно одинаковые геномы. Разница в том, что у позвоночных клетки в ходе дифференцировки лишаются способности реализовать всю генетическую информацию (по выражению биологов, утрачивают тотипотентность), а у растительных клеток тотипотентность сохраняется.

Это различие и стало «камнем преткновения» в клонировании животных (получение растений из соматических клеток «путем бесполого размножения» широко используется уже более 30 лет). Обойти «камень преткновения» пытались многие: одни довольно успешно, другие не очень.

В 1953 г. американские исследователи Бриггс и Кинг, отцы-создатели метода переноса ядра, впервые продемонстрировали возможность клонирования эмбрионов в опытах на африканских шпорцевых лягушках ксенопус. По их данным, при пересадке ядер из клеток зародыша в энуклеированные (т. е. лишенные ядер) яйцеклетки прооперированные икринки благополучно превращались в самых обычных головастиков: в 80% случаев, если ядра извлекались на ранней стадии развития зародыша (стадии бластулы), и в 20% случаев, если доноры ядер находились на более поздней стадии развития (стадии гаструлы).

Несколько позже Гердон модифицировал методу Бриггса и Кинга в опытах с южно-африканскими жабами Xenopus laevis, взяв в качестве донора ядер специализированные клетки кишечного эпителия плавающего головастика.

Ядра из яйцеклеток Гердон удалял не хирургически, как делали его предшественники, а просто разрушал их ультрафиолетовыми лучами.

Судя по результатам первых экспериментов, примерно десятая часть яйцеклеток с подсаженными ядрами образовывала эмбрионы, из которых: 6,5% достигали стадии бластулы, 2,5% — стадии головастика, из 1% эмбрионов развивались взрослые половозрелые особи (по-видимому, из-за того, что для пересадки были случайно взяты ядра половых клеток, которые довольно долго присутствуют среди клеток кишечного эпителия головастика).

Поскольку первые результаты не нашли подтверждения — ни в работах коллег, ни в дальнейших исследованиях самого Гердона — он усложнил эксперимент: доводил реконструированные яйцеклетки до стадии бластулы, извлекал из них ядра и пересаживал в новые энуклеированные яйцеклетки. И не ошибся: благодаря «серийной пересадке» ему удалось увеличить долю нормально развивающихся зародышей, причем более поздних стадий развития.

Несколько лет спустя (уже совместно с Ласки) он снова модифицировал методику: в качестве первичных доноров ядер начал использовать клетки почек, легких и кожи взрослых амфибий, культивированных вне организма в питательной среде. И снова получил весьма обнадеживающие результаты: примерно четверть энуклеированных яйцеклеток после первичной подсадки ядер развивались до стадии бластулы, а после серийных пересадок — до стадии плавающего головастика.

Вдохновленные успехами в клонировании эмбрионов амфибий ученые начали экспериментировать на млекопитающих, в частности, на мышах.

Поначалу неудачно: после удаления пронуклеусов (т. е. ядер мужских и женских половых клеток с одинарным набором хромосом) из оплодотворенных яйцеклеток (зигот) и подсадки в яйцеклетки ядер, выделенных из ранних эмбрионов, зародыши мышей в лучшем случае развивались до стадии бластоцисты. Но в 1977 г. Хоппе и Илменси сообщили, что им удалось получить семь взрослых самок мышей (пять с материнским геномом и две — с отцовским) путем удаления не обоих, а одного пронуклеуса из зиготы, последующей химической обработки оплодотворенной яйцеклетки с целью удвоения хромосомного набора в оставшемся пронуклеусе, выращивания полученных зародышей in vitro до стадии бластоцисты и трансплантации этой самой бластоцисты в матку самки.

Как водится, коллеги Хоппе и Илменси попытались воспроизвести сенсационные эксперименты. Но безуспешно: диплоидные гиногенетические и андрогенетические (проще говоря, зародыши с материнским и отцовским геномами) погибали на стадии бластоцисты.

Примерно тогда же МакГрат и Солтер разработали более щадящую методику извлечения и пересадки ядер, которую практически сразу «взяли на вооружение» многие исследователи.

Манн и Ловел-Бадж, воспользовавшись методикой МакГрата и Солтера, показали, что при пересадке пронуклеусов, выделенных из яйцеклеток, активированных к партогенезу (т. е. развитию без оплодотворения), в энуклеированные зиготы мышей эмбрионы погибают на ранних стадиях развития. Тогда как зародыши, полученные путем трансплантации пронуклеусов из зигот в партеногенетически активированные энуклеированные яйцеклетки, нормально развиваются до рождения.

Сурани с помощью той же методики доказал, что если к гаплоидному (т. е. одинарному) набору хромосом яйцеклетки добавить женский пронуклеус из зиготы, то зародыш погибнет на ранних стадиях развития. Если же вместо женского пронуклеуса добавить мужской, то эмбрион будет развиваться нормально. Мало того, в другой серии экспериментов они показали, что при рекомбинации двух одинаковых пронуклеусов (неважно, женские они или мужские) зародыш гибнет, а при рекомбинации мужского и женского пронуклеусов — нет.

Полученные данные свидетельствовали о том, что нормальное развитие зародышей млекопитающих может обеспечить только наличие мужского и женского хромосомных наборов. По образному выражению профессора Конюхова, «природа поставила замок на удвоение одинарного набора хромосом, так называемый генетический импринтинг. Это значит, что в хромосомах матери «выключены» одни нужные для нормального развития зародыша гены, в хромосомах отца — другие».

Тем не менее Шеттлз занялся пересадкой ядер сперматогониальных клеток (т. е. предшественников зрелых спермиев с двойным хромосомным набором) в энуклеированные человеческие яйцеклетки. Добился он немногого — дробления трех реконструированных яйцеклеток и образования морулоподобного скопления клеток, которое к тому же вскоре деградировало. (Для справки: морула — плотное скопление клеток, образующееся через 50–60 часов после начала дробления). Если бы не запрет на эксперименты с человеческими эмбрионами, следующим этапом в изысканиях Шеттлза стала бы трансплантация морулоподобных клеток в матку женщины, где, по его мнению, они могли бы нормально развиваться.

Но вернемся к опытам на животных.

Вопреки ожиданиям клонирование излюбленного модельного объекта биологов оказалось делом непростым. Во многом — из-за особенностей эмбриогенеза. Клонировать эмбрионы кроликов оказалось куда легче. Другой вопрос — крайне низкий выход: из 164 энуклеированных яйцеклеток с подсаженными ядрами восьмиклеточных эмбрионов удалось получить только 6 кроликов. И что немаловажно, внешне (по выражению генетиков, фенотипически) родившиеся кролики были идентичны породе донора ядер. Притом, что после предварительного культивирования in vitro реконструированные яйцеклетки имплантировались самкам иной, чем у доноров ядер, породы.

Что касается экспериментов на коровах и овцах, то в них использовался иной подход: реконструированные по методике МакГрата и Солтера яйцеклетки помещали на несколько дней в перевязанный яйцевод овцы (иногда в агаровом цилиндре, иногда без оного) и затем подсаживали второму реципиенту — корове или овце.

Именно таким способом Роблу удалось получить двух телят в результате пересадки в зиготы пронуклеусов. Его попытка использовать в качестве доноров ядра 2-, 4- и 8-клеточных зародышей оказалась неудачной: реконструированные яйцеклетки погибали, не успев достигнуть стадии морулы. На первый взгляд, неудача Робла могла быть связана с ранней утратой тотипотентности. Но несколько позже Уиладсин получил четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результате трансплантации в яйцеклетки ядер бластомеров 32-клеточного зародыша. К тому же Уиладсин считал, что это не исключение, а, скорее, правило. По его глубокому убеждению, на 32- клеточной стадии зародыша тотипотентность сохраняет большинство ядер. Значительная часть тотипотентного большинства даже на 64-клеточной стадии обеспечивает нормальное развитие реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы. Более того, после трансплантации в матку коровы зародыши могут и дальше нормально развиваться.

Справедливость вывода Уиладсина подтвердил впоследствии Бондиоли, который получил 92 живых теленка, используя в качестве доноров ядер 16–64-клеточные зародыши. (Всего коровам-рецепиентам трансплантировали 463 реконструированных зародыша.)

В экспериментах на овцах Уиладсин показал, что ядра сохраняют тотипотентность на 16-клеточной стадии развития эмбрионов. По его данным, помещенные в агаровый цилиндр реконструированные яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных зародышей, нормально развивались в перевязанном яйцеводе овцы, а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы их развитие продолжалось еще 60 дней.

В 1989 г. Уилмут, отец-создатель овечки Долли, пересадив в неоплодотворенные энуклеированные яйцеклетки овец ядра 16-клеточного зародыша, получил двух живых ягнят с фенотипом породы донора ядер. Результат трансплантации ядер раннего бластоциста оказался менее удачным: полностью сформировавшийся ягненок (тоже с фенотипом породы донора) погиб во время родов. На взгляд автора исследования, из-за того, что при дифференцировке эмбриональных клеток некоторые важные для развития гены инактивируются. В результате ядра бластоциста уже не могут «перепрограммироваться» в цитоплазме яйцеклетки, а значит, и обеспечить нормальное развитие эмбриона.

Исходя из этого, Уилмут предположил, что в качестве доноров ядер следует использовать культуры эмбриональных клеток с тотипотентными ядрами.

Через несколько лет Уилмут подтвердил свою гипотезу экспериментально.

Суть опытов состояла в следующем. После микрохирургического выделения эмбрионального диска из бластоцисты (точнее, из девятидневного овечьего зародыша) клетки культивировали in vitro в течение многих пассажей. И что очень важно: извлекали ядра на определенной стадии деления культивируемых клеток, сходной со стадией клеточного цикла цитоплазмы энук- леированной яйцеклетки на момент пересадки ядер.

После чего реконструированные яйцеклетки в агаровых контейнерах помещали в перевязанный яйцевод овцы. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода, исследовали под микроскопом и, отобрав зародыши, достигшие стадии морулы или бластоцисты, пересаживали их в матку овцы.

В результате таких манипуляций родилось пять живых ягнят: двое погибли практически сразу после рождения, третий - через десять дней, остальные нормально развивались до девятимесячного возраста.

Вскоре Уилмут провел еще три серии экспериментов — с эмбриональными клетками, фибробластоподобными клетками плода и клетками молочной железы шестилетней овцы, находящейся на последнем триместре беременности: эмбриональные клетки в качестве доноров ядер использовали на 7–9 пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода — на 4–6 пассажах и клетки молочной железы — на 3–6 пассажах. Как и в предыдущем исследовании, Уилмут синхронизировал стадии клеточного цикла яйцеклеток-рецепиентов и клеток-доноров ядер. В результате ему удалось получить семь живых ягнят: двое развились из реконструированных яйцеклеток, содержащих ядра фибробластоподобных клеток ядра. Четверо — из яйцеклеток, содержащих ядра эмбриональных клеток, и один — из яйцеклетки, содержащей ядро культивированной клетки молочной железы. Шесть ягнят через какое-то время погибли. Последний ягненок, клонированный из клетки молочной железы, выжил и стал известен широкой публике как овечка Долли.

Однако сказать, что рождение Долли ознаменовало решение проблемы клонирования, нельзя. Ученые так и не смогли разобраться в причинах гибели 276 из 277 энуклеированных яйцеклеток, в которые были подсажены ядра клеток молочной железы. До сих пор остается непонятным, почему у Долли на пятом году жизни развился артрит, почему она так быстро состарилась. Версия о том, что из-за почтенного возраста донора ядер овечка появилась на свет немолодой особой, кажется маловероятной.

Хотя бы потому, что бычки, клонированные позднее американским ученым Янгом по методе Уилмута, оказались моложе своего биологического - возраста. (Для справки: в качестве доноров ядер Янг использовал клетки ушной раковины 17-летнего быка; биологический возраст в обоих случаях определялся по величине теломер — небольших образований на концах хромосом, которые по мере старения организма имеют свойство укорачиваться.)

Правда, ученые из Уайтхедовского института биомедицинских исследований, определив активность 10 тыс. генов в различных тканях клонированных мышей и выявив серьезные нарушения регуляции многих генов, пришли к выводу, что именно этими нарушениями объясняются проблемы со здоровьем и меньшая продолжительность жизни клонов. Если это действительно так, то чем тогда обусловлен феномен «омоложения», открытый Янгом? Пока непонятно. Как непонятно и явление, обнаруженное группой американских ученых в опытах по клонированию мышей.

Суть его состоит в том, что каждое последующее поколение клонов мышей клонируется хуже предыдущего.

Попытка объяснить торможение клонирования укорочением теломер оказалась несостоятельной: прогнозируемого укорочения теломер в «поздних» поколениях клонов обнаружить не удалось. Не выдержала экспериментальной проверки и вторая версия — ухудшение здоровья каждого последующего поколения клонов мышей: клоны 4–5 поколений в выполнении тестов ни в чем не уступали клонам предыдущих поколений. Единственным свидетельством в пользу третьей версии о «какой-то приобретенной аномалии, которую несут в себе мыши-клоны», можно считать поедание суррогатной матерью новорожденного детенышаклона в шестом поколении. Вопрос в том, смогут ли ученые выявить вышеупомянутый дефект и доказать, что именно из-за него возникают проблемы с клонированием.

Терапевтическое клонирование, или запчасти для организма

Потенциально из эмбриональных стволовых клеток можно получить любые специализированные клетки, из соматических — лишь некоторые. Но для реализации потенциала необходимо управлять процессом дифференцировки, задать ему «нужное направление». Как это сделать, пока неизвестно.

Тем не менее, исследователям из университета Глазго недавно удалось получить клетки костной ткани из стволовых клеток, не используя для запуска дифференцировки никаких химических факторов. Роль более привычных (и не всегда эффективных) химических стимуляторов сыграли крохотные (меньше 100 нанометров в диаметре) ямки на поверхности полимера для выращивания клеток.

Получали наноямки методом электронной литографии, который традиционно применяется при производстве компьютерных микрочипов. Проще говоря, бомбардировали электронными пучками специальный полимер, использовали его для металлической отливки и с ее помощью формировали отпечатки на поверхности уже другого, предназначенного для выращивания клеток, полимера.

Самое интересное, что и полностью упорядоченное, и полностью беспорядочное расположение наноямок давало тот же эффект, что и совершенно гладкая поверхность подложки: стволовые клетки, помещенные в питательную среду, росли, но не дифференцировались. Но стоило в строго упорядоченный нанорисунок внести немного беспорядка, как стволовые клетки начали дифференцироваться в клетки костной ткани.

Почему дифференцировка пошла именно в этом направлении и стволовые клетки не превратились, к примеру, в мышечные или жировые клетки, для ученых осталось загадкой. Так что об управляемой дифференцировке пока можно только мечтать: без понимания механизмов влияния структуры поверхности на направление развития стволовых клеток осуществить ее невозможно.

Три года назад в журнале New Scientist появилось сообщение об удивительно простом методе создания искусственных органов и тканей, разработанном группой американских ученых во главе с профессором Владимиром Мироновым.

Суть метода заключается в последовательном «впечатывании» клеток в трехмерный гелевый каркас в форме будущего органа при помощи самого обычного настольного принтера. Правда, с модифицированным картриджем.

Процесс «конструирования» ткани (на момент публикации до создания органов дело не дошло) состоял в нанесении суспензий функциональных клеток на тончайшие гелевые пластинки. Затем пластинки в определенном порядке накладывались друг на друга, и после того, как они склеивались, создавая требуемый клеточный конгломерат, нагреванием до 32 °С гель удаляли.

Владимир Миронов сравнил разработанный под его руководством метод с изобретением печатного станка. А в одном из интервью сказал: «Никто не мешает нам «впечатать» в гелевые слои не только функциональные клетки, но и элементы стенок кровеносных сосудов и даже отдельные нейроны. Кроме того, разработанный нами метод позволяет получать нужные результаты намного быстрее, чем традиционные. Сейчас на создание слоя ткани толщиной 5 см у нас уходит около двух часов, следовательно, на построение целого органа с учетом его более сложного клеточного состава будет затрачено 4–6 часов».

Научная общественность к новой технологии отнеслась сдержанно. Пожалуй, только директор Института регенеративной медицины, доктор Энтони Атала оценил ее как «потрясающую, с потенциалом, способным преодолеть те препятствия, с которыми ученые сталкивались в прошлом».

Надо сказать, что сам Энтони Атала к тому времени разработал методику выращивания в пробирке кроличьих пенисов. Точнее, их частей, кои и пересаживал прооперированным животным. После чего у кроликов восстанавливалась эрекция, и они могли спариваться. До выращивания мужских детородных органов дело не дошло. Тем более, что даже кроличий пенис не удалось вырастить полностью по причине его сложной анатомии.

Зато Энтони Атале, вернее коллективу исследователей под его руководством, как справедливо заметил Владимир Миронов, удалось сделать то, что не удавалось еще никому: слепить не просто однородные клетки, а клетки мышц и стенок мочевого пузыря.

Для этого понадобилось «отщипнуть» кусочек больного органа у пациента, отделить клетки мышц от клеток стенок мочевого пузыря, размножить их, перенести на коллагеновый каркас и потом растворить этот самый каркас.

В 1999–2001 гг. в Children’s Hospital Boston девяти детям с недостаточной функцией мочевого пузыря, обусловленной врожденным дефектом позвоночника, была проведена пересадка органов, сотворенных из их собственных клеток. Главным образом, для того, чтобы уменьшить давление внутри пузыря и тем самым защитить от поражения почки.

Судя по публикации в апрельском номере The Lancet за 2006 год, после трансплантации у трех мальчиков и четырех девочек почки функционируют нормально. И что не менее важно, у них нормализовалась частота мочеиспускания (до операции дети страдали недержанием мочи). Что случилось с остальными пациентами, неизвестно: по словам Аталы, они перестали появляться в клинике.

Ради объективности нельзя не упомянуть о том, что в подобных случаях больным обычно пересаживают мочевые пузыри, сформированные из их же тканей, — кишечника или желудка. Но поскольку основная функция этих тканей всасывающая (а не выделительная, как у мочевого пузыря), трансплантация сформированных из них пузырей нередко приводит к остеопорозу, образованию камней, а иногда — и к развитию злокачественных новообразований. После пересадки мочевого пузыря из пробирки ни у одного из пациентов каких-либо осложнений не наблюдалось.

В ближайшее время Энтони Атала надеется получить разрешение властей на проведение широкомасштабных клинических испытаний. Но останавливаться на этом он не намерен. В планах Аталы — разработка методик выращивания как минимум 20 органов и тканей. Первыми в списке стоят трахея, мышцы и почки — их относительно легко сформировать на каркасе.

Л. В. Львова, к. биол. наук





© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика