Логотип журнала "Провизор"








Проблема глобального масштаба

Л. В. Львова, к. биол. наук

«Действуя на микробы, следует помнить об их собственных интересах», — говорил И. П. Павлов, пытаясь умерить восторги коллег по поводу успешного применения «красного стрептоцида», родоначальника сульфаниламидов. И оказался прав. Бактерии, действительно, стали отстаивать свои интересы в борьбе с антибактериальными препаратами в целом и с антибиотиками в частности. Да так рьяно, что за каких-то пару десятилетий антибиотикорезистентность стала проблемой глобального масштаба.

Гены решают все

Генетический аппарат бактерий весьма прост — одна-единственная хромосома, содержащая около 3 тыс. генов, и плазмиды — крохотные, включающие не более 200 генов, чрезвычайно мобильные ДНК-молекулы. Они-то, вернее, «гены адаптации», присутствующие в них, и позволяют бактериям выживать в экстремальных условиях.

Многие из «генов адаптации», включая гены атибиотикорезистентности, являясь транспозонами («прыгающими» генами), легко перемещаются (к примеру, из плазмиды в плазмиду или в хромосому), что обеспечивает их быстрое распространение внутри популяций, видов и даже между различными видами бактерий.

Антибиотикорезистентность специалисты подразделяют на природную и приобретенную.

Природная, или первичная, резистентность закодирована в хромосомных генах и имеет место изначально, еще до «встречи» с антибиотиком. Пример тому — природная устойчивость Micoplasms spp. к β-лактамам и грамотрицательных бактерий к макролидам. Разница лишь в том, что в первом случае неуязвимость бактерий связана с отсутствием мишени (Micoplasms spp. лишены клеточных стенок, тогда как β-лактамы реализуют свое антимикробное действие через пенициллинсвязывающие белки, локализованные в бактериальных клеточных стенках). А во–втором — с недоступностью мишени по причине непроницаемости клеточной стенки грамотрицательных бактерий для макролидов.

Приобретенная, или вторичная, резистентность обусловлена либо спонтанными мутациями, либо «приобретением» генов устойчивости, переносимых транспозонами или плазмидами.

В образовании генов устойчивости антибиотики не участвуют. (Подтверждением тому могут служить гены атибиотикорезистентности, обнаруженные у штаммов, законсервированных задолго до внедрения антибиотиков.)

Но в развитии резистентности они участие принимают — в качестве факторов селекции: в присутствии антибиотиков «в живых» могут остаться только резистентные клоны, «из которых формируется устойчивая популяция — вплоть до устойчивого вида, как в случае пенициллиноустойчивых стафилококков». И что характерно, процесс отбора идет своим чередом, независимо от того, правильно используются антибиотики или нет.

Здесь уместно вспомнить, что вопреки бытующему мнению развитие резистентности, во-первых, не является неизбежным при длительном использовании антибиотика. (Свидетельство тому — чувствительность Enterococcus faecalis к ампициллину, не изменяющаяся на протяжении десятилетий.)

Во-вторых, не связано с широким применением антибиотика: резистентность может развиться в течение первых двух лет его применения или даже на стадии клинических испытаний. (Что и произошло с ванкомицином, гентамицином, цефамандолом и ципрофлоксацином.)

Как бы то ни было, но в отсутствии антибиотиков приобретенная устойчивость сохраняется. Несмотря на то, что за ее поддержание бактериям приходится «платить»: меньшей приспособленностью к окружающей среде, замедленной скоростью роста и возросшей — по причине синтеза дополнительных белков и нуклеиновых кислот — метаболической нагрузкой. В конце концов им, вернее их потомкам, все-таки удается освободиться от «метаболической дани». Один из возможных механизмов подобной компенсации — появление новых мутаций в бактериальном геноме получил экспериментальное подтверждение в работах Scrag et al.

В первой работе, изучая устойчивый к стрептомицину штамм E. coli, исследователи обнаружили, что поначалу каждое поколение резистентного штамма бактерий уступало родственным диким штаммам в скорости роста как минимум на 14%. После того, как в отсутствии антибиотиков сменились 180 поколений резистентного штамма, «дань» за поддержание резистентности существенно сократилась. В дальнейшем Scrag et al доказали, что мутации, приведшие к возникновению резистентности у E. coli, компенсируются мутациями в другом участке бактериального генома и что именно благодаря этим новым мутациям сокращаются «потребности» резистентных штаммов. Причем ощутимо. Как оказалось, штаммы, чувствительные к стрептомицину, испытывают гораздо большую потребность в ресурсах в сравнении со своими резистентными собратьями.

Каким образом штамму Escherichia coli, устойчивому к хлорамфниколу и тетрациклину, через 500 поколений удалось полностью освободиться от «метаболической дани» и победить своих антибиотикочувствительных сородичей, непонятно. Видимо исследователи Bouma и Lenski не ставили перед собой такой задачи.

Но факт остается фактом: отдаленным потомкам приобретенная резистентность явно пошла на пользу. Даже в отсутствии антибиотиков.

На войне как на войне

Задача антибиотика — подавить жизнедеятельность бактерии. Для этого ему необходимо проникнуть в бактериальную клетку, и вступить во взаимодействие с мишенями.

Задача бактерии — противостоять губительному действию антибиотика.

В арсенале бактерий (естественно, антибиотикоустойчивых) имеется пять биохимических механизмов реализации резистентности: модификация мишени действия антибиотика, инактивация самого антибиотика, уменьшение проницаемости внешних структур бактериальных клеток, формирование новых метаболических путей и активное выведение антибиотика из бактериальной клетки.

Первый механизм играет ведущую роль в противостоянии бактерий хинолонам, фторхинолонам, макролидам, линкозамидам и гликопептидам.

Хинолоны и фторхинолоны опосредуют свое антимикробное действие через бактериальные ферменты — ДНК-гиразу и топоизомеразу IV. В норме оба фермента отвечают за репликацию бактериальной ДНК.

Для фторхинолонов обе мишени равноценны, поскольку они обладают примерно одинаковым сродством к ДНК-гиразе и топоизомеразе IV.

Для хинолонов — неравноценны: если у грамотрицательных бактерий наибольшее сродство они проявляют к ДНК-гиразе, то у грамположительных — к топоизомеразе IV.

И устойчивость к хинолонам, и устойчивость к фторхинолонам обусловлена спонтанными мутациями в бактериальной хромосоме, точнее, в генах, кодирующих ферменты. Но для формирования устойчивого штамма в первом случае достаточно одиночной мутации, а во втором — мутации должны одновременно появиться в генах обоих ферментов, что случается гораздо реже.

В отличие от хинолонов и фторхинолонов макролиды и линкозамиды реализуют свое действие через одну-единственную мишень, представленную 50S субъединицей бактериальной рибосомы.

Большинство бактерий реализуют свою устойчивость с помощью метилазы: фермент метилирует 23S-субъединицу рибосомальной РНК и тем самым препятствует связыванию антибиотиков с рибосомой.

На сегодняшний день известно около двух десятков генов, кодирующих метилазу (некоторые из них локализованы на плазмидах, некоторые — на хромосомах) и описаны два типа синтеза метилазы: конститутивный, от внешних условий не зависящий, и индуцибельный, срабатывающий исключительно в присутствии антибиотиков.

Бактерии с констутивным типом синтеза метилазы устойчивы абсолютно ко всем макролидам и линкозамидам. Столь же широким спектром устойчивости обладают и стрептококки. Но по другой причине: у них синтез метилаз индуцируют все макролиды и линкозамиды.

У стафилококков резистентность распространяется только на 14- и 15-членные макролиды, поскольку синтез фермента индуцируется именно этими антибиотиками. К 16-членным макролидам и линкозамидам они сохраняют чувствительность.

Надо заметить, что метилирование 23S-субъединицы рибосомальной РНК — не единственный механизм модификации мишени. Есть и другие.

К примеру, мутации в генах рибосомальных белков L4 и L22 вызывают снижение чувствительности к макролидам и линкозамидам у S.pneumoniae, S.pyogenes и S.oralis. Мутации в V домене 23S-субъединицы рибосомальной РНК приводят к формированию клинически значимой перекрестной резистентности ко всем макролидам и линкозамидам у S.pneumoniae, Mycobacterium spp., Propionibacterium spp., B.pertussis, H.influenzae и H.pylori.

Гликопептиды реализуют свое антимикробное действие, связываясь с концевыми аминокислотами боковой пептидной цепи, и таким образом блокируют завершающую стадию синтеза пептидогликана.

Бактерии, со своей стороны, противостоят действию антибиотиков. Одни — за счет комплексов генов, локализованных на плазмидах, другие — за счет комплексов генов, локализованных в хромосомах. Результат в обоих случаях, в целом, одинаковый — модификация боковой пептидной цепи. Но только в целом: если экспрессия плазмидного генного комплекса обеспечивает высокую резистентность к ванкомицину и тейкоплакину, то экспрессия комплекса хромосомных генов влияет исключительно на восприимчивость бактерий к ванкомицину. На чувствительности к тейкоплакину она никак не отражается.

β-лактамы, как и гликопептиды, реализуют свое антимикробное действие, воздействуя на клеточные стенки бактерий.

В этом случае бактерии тоже прибегают к модификации мишени — пенициллинсвязывающих белков. Но изредка. Гораздо чаще они используют другой механизм устойчивости — инактивацию самих антибиотиков путем ферментативного гидролиза одной из связей β-лактамного кольца.

Все известные на сегодняшний день β-лактамазы (более 200 ферментов) подразделяются на четыре молекулярных класса (А, В, С и D) в зависимости от таких практически важных свойств:

  • субстратный профиль (т. е. способность к преимущественному гидролизу определенных β-лактамов);
  • локализация кодирующих генов (эта характеристика определяет эпидемиологию резистентности: плазмидные гены обеспечивают быстрое внутрии даже межвидовое распространение устойчивости, хромосомные гены — распространение резистентного штамма);
  • чувствительность к используемым в медицинской практике ингибиторам — клавулоновой кислоте, сульбактаму и тазобактаму.

β-лактамазы классов А, С и D — ферменты «серинового» типа (их активные центры содержат аминокислоту серин). Предполагается, что представители этих трех классов ферментов являются видоизмененными пенициллинсвязывающими белками почвенных экосистем. (Изменения произошли вследствие селективного давления β-лактамных антибиотиков, продуцируемых некоторыми микроорганизмами.)

Относительно происхождения β-лактамаз класса В предположения отсутствуют. В отличие от ферментов трех других классов, они причисляются к металлоэнзимам (в них в качестве кофермента присутствует атом цинка), способны разрушать карбапанемы и распространены, в основном, среди редких микроорганизмов (к примеру, S.maltophlia).

Больше всего распространены стафилококковые β-лактамазы класса А (они встречаются у 60–80% стафилококковых штаммов) и β-лактамазы широкого спектра класса А грамотрицательных бактерий (они встречаются у 30–40% штаммов E.coli).

Клинической значимости широкое распространение этих ферментов не имеет, поскольку многие современные β-лактамы — цефалоспорины II-IV поколений, ингибиторозащищенные пенициллины, карбапанемы — не подвержены их действию (табл. 1). С клинической точки зрения реальную опасность представляют плазмидные β-лактамазы расширенного спектра класса А грамотрицательных бактерий. Чаще всего подобные β-лактамазы, способные разрушать цефалоспорины III поколения и, в меньшей степени, цефалоспорины IV поколения (табл. 1), встречаются у бактерий рода Klebsiella, E.coli и Proteus spp. Кроме того, озабоченность клиницистов вызывает наблюдаемая в последнее время мобилизация ферментов класса С на плазмиды.

 

Таблица 1. Наиболее распространенные β-лактамазы и их свойства (Практическое руководство по антибактериальной терапии/Под ред. Л. С. Страчунского)

Ферменты Характеристика
Плазмидные β-лактамазы класса А стафилококков Гидролизуют природные и полусинтетические пенициллины, кроме метициллина и оксациллина. Чувствительны к ингибиторам.
Плазмидные β-лактамазы широкого спектра класса А грамотрицательных бактерий Гидролизуют природные и полусинтетические пенициллины, цефалоспорины I поколения. Чувствительны к ингибиторам.
Плазмидные β-лактамазы расширенного спектра класса А грамотрицательных бактерий Гидролизуют природные и полусинтетические пенициллины, цефалоспорины I-IV поколения. Чувствительны к ингибиторам.
Хромосомные β-лактамазы класса С грамотрицательных бактерий Гидролизуют природные и полусинтетические пенициллины, цефалоспорины I-III поколения. Не чувствительны к ингибиторам.
Хромосомные β-лактамазы класса А грамотрицательных бактерий Гидролизуют природные и полусинтетические пенициллины, цефалоспорины I-II поколения. Не чувствительны к ингибиторам.
Плазмидные β-лактамазы широкого спектра класса D грамотрицательных бактерий (преимущественно P.aeruginos) Гидролизуют природные и полусинтетические пенициллины, цефалоспорины I-III поколения. Большинство не чувствительны к ингибиторам.

 

Главным механизмом устойчивости к аминогликозидам также является ферментативная инактивация антибиотика. Только здесь ферменты действуют иначе — модифицируют молекулы аминогликозидов таким образом, что они утрачивают способность связываться с бактериальными рибосомами и подавлять синтез белка. И что немаловажно с точки зрения эпидемиологии резистентности, гены, кодирующие ферменты-модификаторы, локализуются исключительно на плазмидах.

На сегодняшний день известны три группы таких ферментов:

  • группа ААС, в которую входят ферменты, присоединяющие к молекуле аминогликозида молекулу уксусной кислоты;
  • группа APH, в которую входят ферменты, присоединяющие к молекуле аминогликозида молекулу фосфорной кислоты;
  • группа ANT, в которую входят ферменты, присоединяющие к молекуле аминогликозида молекулу нуклеотида аденина.

Ферменты-модификаторы, встречающиеся у грамотрицательных бактерий, отличаются большим разнообразием (табл. 2).

 

Таблица 2. Характеристика наиболее распространенных ферментов-модификаторов аминогликозидов (Практическое руководство по антибактериальной терапии/Под ред. Л. С. Страчунского)

Ферменты Устойчивость к антибиотикам
Грамположительные микроорганизмы
АРН (3’)-III Канамицин, неомицин, амикацин
ANT (4’)-I Тобрамицин, амикацин
ANT (6)-I Стрептомицин
AAC (6’)-APH (2») Гентамицин, тобрамицин, нетилмицин, амикацин
Грамотрицательные микроорганизмы
ANT (2’) Канамицин, гентамицин, тобрамицин
AAC (2’) Гентамицин, тобрамицин, нетилмицин
AAC (3)-V Гентамицин, тобрамицин, нетилмицин
AAC (3)-I Гентамицин
AAC (6’)-I Тобрамицин, амикацин, нетилмицин
АРН (3’)-I Канамицин, неомицин
АРН (3’)-II Канамицин, неомицин
АРН (3’)-VI Канамицин, амикацин

 

Как показывает практика, некоторые грамотрицательные бактерии могут иметь в своем распоряжении фактически все комбинации устойчивости к определенным аминогликозидам. (Причины тому две — уникальность субстратного профиля каждого фермента и наличие нескольких генов, кодирующих ферменты-модификаторы.)

Спектр ферментов-модификаторов, встречающихся у грамположительных бактерий не столь разнообразен (табл. 2). С клинической точки зрения определенное значение имеет распространение бифункционального фермента AAC (6’)-APH (2»), способного модифицировать все аминогликозиды за исключением стрептомицина и спектиномицина. Маркером наличия этого фермента может служить устойчивость к гентамицину: судя по данным, приведенным в табл. 2, все остальные ферменты, встречающиеся у грамотрицательных бактерий, гентамицин не инактивируют.

И у грамположительных, и у грамотрицательных бактерий встречаются ферменты, инактивирующие макролиды и линкозамиды. Одни из них, — к примеру, макролидфосфотрансферазы E.coli и Staphylococcus spp.— обладают широким субстратным профилем. Другие, — к примеру, эритромицинэстеразы семейства Enterobacteriaceae, линкомицинацетилтрансферазы стафилококков и энтерококков — способны инактивировать лишь некоторые антибиотики. Но все они клинического значения не имеют.

Некоторые бактерии «взяли на вооружение» иной механизм устойчивости — формирование нового метаболического пути, неуязвимого для антибиотика. Иллюстрацией тому могут служить S.aureus, которые благодаря мутациям обрели способность синтезировать дополнительный пенициллинсвязывающий белок — ПСБ2а. Этого оказалось достаточно для полноценного синтеза клеточной стенки и, что самое главное, для формирования резистентности не только к антистафилококковым β-лактамам — метициллину и оксациллину, но и ко всем β-лактамным антибиотикам. (К слову сказать, устойчивость к метиллину и оксациллину является маркером наличия ПСБ2а.)

Некоторые грамотрицательные бактерии научились ускользать от тех же β-лактамов другим способом: за счет снижения численности или радиуса пор, образованных так называемыми пориновыми белками. (Поры находятся в наружной фосфолипидной мембране, прикрывающей пенициллинсвязывающие белки.) У энтеробактерий, к примеру, штаммы с низкой резистентностью к цефалоспоринам появились под влиянием терапии цефокситином вследствие утраты двух пориновых белков — OmpF и OmpC. У некоторых же бактерий полная или частичная утрата пориновых белков приводит к формированию устойчивости одновременно к нескольким группам антибиотиков.

Еще один механизм множественной устойчивости к антибиотикам связан с системами активного выведения ксенобиотиков, именуемых «помпами» и состоящих из специфических белков.

Помпа грамотрицательной бактерии представляет собой достаточно сложную конструкцию, пересекающую обе мембраны и периплазматическое пространство между ними. Состоит эта конструкция как минимум из трех белков:

  • белка-транспортера, который выбрасывает ксенобиотик, проникающий в цитоплазматическую мембрану, в периплазматическое пространство;
  • белка-каналообразователя, находящегося над белком-транспортером и выбрасывающего ксенобиотик из бактериальной клетки;
  • белка-линкера, расположенного в периплазматическом пространстве и связывающего белок-транспортер с белком-каналообразователем.

Грамположительные бактерии в столь громоздких конструктах не нуждаются. Чтобы избавиться от ксенобиотика, достаточно белка-транспортера — вторая мембрана у грамотрицательных микроорганизмов отсутствует.

Большинство защитных систем активного выброса отличаются чрезвычайно широкой специфичностью в отношении липофильных и амфифильных субстратов с молекулярной массой от 1500 до 2000 Да. Применительно к антибиотикам это означает, что одна и та же помпа может удалять из клетки несколько совершенно различных — как по структуре, так и по механизму действия — препаратов. Именно этим обстоятельством объясняется множественная резистентность, наблюдаемая у P.aeruginosa (табл. 3).

 

Таблица 3. Системы активного выброса антибиотиков у P.aeruginosa (Ю. О. Сазыкин и др. Антибиотикорезистентность и системы активного выброса ксенобиотиков у бактерий)

Белок-
транспортер
Белок-
линкер
Белок-
каналообразователь,
пересекающий внешнюю мембрану
Субстраты
MexB MexA OprM Тетрациклин, хлорамфеникол (за исключением карбапенемов), фторхинолоны, новобиоцин, эритромицин, фузидиевая кислота, рифапентин
MexD MexC OprJ Тетрациклин, хлорамфеникол, фторхинолоны, четвертая генерация цефемов* (но не обычные β-лактамы или карбапенемы)
МexF MexЕ OprN Хлорамфеникол, фторхинолоны, карбапенемы (но не обычные β-лактамы и не четвертая генерация цефемов)

 

С системой активного выброса связана и обнаруженная недавно у многих штаммов грамотрицательных бактерий устойчивость к карбенициллину. Но объяснить этот феномен пока не удается: мишень расположена на наружной стороне цитоплазматической мембраны, а система активного выброса распознает субстраты на стадии их проникновения в эту самую мембрану. Остаются без объяснения и результаты исследования, продемонстрировавшие повышение роли системы активного выброса антибиотиков у P.aeruginosa непосредственно в условиях клиники. Исследователи констатируют, что при лечении антипсевдомонадными бета-лактамами у всех обследованных больных развивается резистентность: у одних пациентов из-за гиперпродукции β-лактамазы класса С. А у других — из-за гиперпродукции белка-каналообразователя Opr M.

Объективности ради замечу, что в последнее время у бактерий были обнаружены помпы, «специализирующиеся» на выбросе гидрофильных аминогликозидов. И, судя по всему, перечень систем активного выброса антибиотиков будет пополняться и дальше.

P. S.

Антибиотикотерапия становится неэффективной, когда количество резистентных штаммов превышает некий пороговый уровень. Эти результаты клинических исследований в равной мере относятся как к возбудителям внебольничных, так и к возбудителям внутрибольничных инфекций. Но есть одно но.

Характер и выраженность резистентности возбудителей нозокоминальных инфекций во многом зависит от профиля клинического отделения и традиций использования антибиотиков в этом отделении. Профиль резистентности возбудителей внебольничных инфекций обычно не отличается в разных регионах страны (в силу общих для страны традиций применения антибиотиков). И в то же время распространенность резистентности может существенно различаться в разных странах. К примеру, уровень резистентности S.pneumonia к эритромицину составляет 57,6% во Франции, 55,6% в Венгрии и 6,2–6,8% в России. Во Франции и в Венгрии макролиды утратили статус препаратов выбора для лечения внебольничных пневмококковых инфекций. (По данным клинических исследований, лечение подобных инфекций становится неэффективным, когда численность устойчивых штаммов «преодолевает» 20–30% рубеж).

По ряду причин Украина достоверными данными о распространенности антибиокорезистентности пневмококков и других клинически значимых возбудителях внебольничных инфекций не располагает. Отечественные специалисты вынуждены использовать результаты микробиологических исследований других стран, что, мягко говоря, отнюдь не облегчает корректировку стандартов антибиотикотерапии.

Литература

  1. Cunha B. A. Antibiotic resistance: a historical perspective // Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine 2000.
  2. И. Г. Березняков. Проблема антибиотикорезистентности в практике врача-интерниста // m-l.com.ua
  3. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии/Под ред. Л. С. Страчунского, Ю. Б. Белоусова, С. Н. Козлова. — М.: Боргес, 2002.
  4. Синопальников А. И., Гучев И. А. Макролиды: современная концепция применения // Рус. мед. журнал. — 2003. — Т. 11. — № 2.
  5. Erik R. Dubberke, MD, Victoria J. Fraser. Чередование и другие стратегии замедления и реверсирования антибиотикорезистентности // http://www.medscape.com
  6. Страчунский Л. C. Антибиотикорезистентность как угроза национальной безопасности // www.bio.su
  7. Сазыкин Ю. О., Швец А. В., Иванов В. П. Антибиотикорезистентность и системы активного выброса ксенобиотиков у бактерий // Антибиотики и химиотерапия. — 1999. — № 9.




© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика