Логотип журнала "Провизор"








Потенциальные возможности

Л. В. Львова, канд. биол. наук

По уровню научно-исследовательских работ Украина стоит в одном ряду с мировыми лидерами в области биосенсорики — Японией, США, Англией, Германией и Францией. Коммерциализация биосенсоров могла бы начаться десять лет назад. Но не началась. Ни один из многочисленных отечественных биосенсоров и поныне не запущен в массовое производство.

Биосенсоры: какие они?

Биосенсор по сути представляет собой минианализатор для безреагентного анализа соединений. Состоит этот минианализатор из биологически чувствительного элемента и физического преобразователя (рисунок). Основная функция биологического элемента — распознать искомое соединение и передать полученную информацию на физический преобразователь, где она будет зафиксирована в виде электронных сигналов. Другими словами, изменение физико-химических свойств биологической матрицы преобразуется в электронный сигнал, амплитуда которого зависит от концентрации в среде определенного вещества.

 

Рисунок 1. Принципиальная схема биосенсора

 

В роли биологического компонента могут выступать представители двух групп: каталитической (т. е. ферменты, ткани или микроорганизмы) и некаталитической (т. е. антитела, антигены, рецепторы, ДНК или нуклеиновые кислоты).

У каждого используемого элемента есть свои достоинства и недостатки.

Взять хотя бы ферменты. Биосенсоры на их основе отличаются высокой селективностью. Естественно, если фермент верно иммобилизован, т. е. «закреплен» на том или ином носителе (к примеру, целлюлозе). Это, по утверждению специалистов, дело весьма кропотливое, требующее соблюдения целого ряда требований.

Одно из основных требований — сохранность стабильности фермента при иммобилизации. Причем желательно, чтобы реагенты, образующие поперечные сшивки, взаимодействовали, в основном, с химическими группами, не входящими в состав активного центра фермента. Если это условие невыполнимо (что чаще всего и бывает на практике), то ничего не остается, как выбрать реагент максимально больших размеров и тем самым ограничить возможность его проникновения в активный центр. Между тем нельзя забывать о защите самого активного центра фермента, и из всех известных способов защиты нужно выбрать оптимальный. (Для сульфгидрильных ферментов, к примеру, таковым является предварительная обработка глутатионом или цистеином с последующей реактивацией уже иммобилизованных ферментов.)

По окончании реакции иммобилизации необходимо удалить свободный, «непришитый» фермент. Да так, чтобы при отмывке не пострадал иммобилизованный фермент. Это накладывает определенные ограничения на применение носителей. В частности, целлюлозные носители не подходят ферментам сложным, состоящим из нескольких субъединиц: подобные носители настолько сильно адсорбируют ферменты, что после иммобилизации их нужно отмывать растворами с высокой ионной силой. А это чревато потерей активности вследствие диссоциации фермента на субъединицы. Вдобавок ко всему нужно учитывать еще физические и механические свойства носителей.

Словом, создание ферментных биосенсоров — задача трудоемкая. К тому же многие ферменты дороги и быстро теряют свою активность. Иное дело — сенсоры на основе биологических тканей. Они, правда, уступают ферментным сенсорам в селективности и во времени отклика. Зато при их изготовлении отпадает необходимость в получении, очистке и иммобилизации ферментов. Наверное, этими качествами вместе со способностью к длительному сохранению высокой специфичности и объясняется повышенный интерес к разработке конструкций электродов, в которых источниками ферментов выступают тканевые срезы.

Недавно, например, создан биосенсор на аскорбиновую кислоту, состоящий из кислородного электрода и пластины огуречной или тыквенной кожуры. Естественного источника аскорбиноксидазы хватает примерно на восемьдесят определений аскорбиновой кислоты. И что немаловажно: природную матрицу без потери активности можно до года хранить в 50-процентном глицерине. Неплохо зарекомендовал себя и биосенсор с иммобилизованной на электроде тканью плода банана, используемый для определения допамина — важнейшего биогенного амина, участвующего в регуляции деятельности мозга.

Достаточно большим разнообразием отличаются и преобразователи, используемые в биосенсорах. Но среди этого разнообразия можно выделить:

  • группу электрохимических преобразователей, образованную амперометрическими, потенциометрическими, кондуктометрическими и емкостными преобразователями;
  • группу оптических преобразователей, способных регистрировать изменение оптических свойств;
  • группу калориметрических преобразователей, пригодных для измерения незначительных изменений температуры;
  • группу акустических преобразователей, предназначенных для измерения акустических свойств исследуемого объекта.

Наибольшей популярностью на сегодняшний день пользуются амперометрические датчики. Особенно когда дело касается биологических сред, где с их помощью можно определить мизерные концентрации субстрата — до 10–15 Моль/л. Причем довольно быстро, поскольку отклик сенсора не зависит от массопереноса электроактивных частиц к поверхности электрода, который, кстати говоря, ухудшает селективность электрода и усложняет его стандартизацию. Сам же амперометрический метод детекции основан на измерении электрического тока, генерируемого при окислении (или восстановлении) электроактивных частиц на поверхности рабочего электрода при постоянном потенциале. К примеру, глюкосенсор на основе платинового электрода Кларка фиксирует ток восстановления кислорода, уменьшение которого пропорционально концентрации глюкозы в анализируемой крови. При изменении полярности включения кислородного электрода в глюкозном биосенсоре, электрод становится совершенно нечувствительным к кислороду. Зато начинает откликаться на присутствие пероксида водорода — продукта ферментативной реакции, что позволяет и такой трансформированный электрод использовать для определения той же глюкозы. (К слову, аналогичным способом можно определять и другие субстраты — лактаты, L-аминокислоты, салицилаты, оксалаты и пируваты.)

Амперометрические преобразователи пригодны и для решения обратной задачи — оценки активности фермента по величине измеряемого тока при некоторой определенной концентрации субстрата. Впрочем, в равной мере это относится и к потенциометрическим датчикам, действие которых основано на измерении разности потенциалов при постоянном (как правило, нулевом) токе между активным электродом и электродом сравнения. Подобные биосенсоры нашли применение в медицине. В частности, в кардиологии, где информация об активности аспартаминотрансферазы и креатинкиназы позволяет оценить глубину инфаркта в клинических условиях.

Принцип действия емкостных биосенсоров базируется на измерении емкости двойного слоя на границе раздела электрод/электролит и диэлектрических свойствах мембран. Подобные датчики с успехом используются в некоторых иммуносенсорах, где связывание антител с антигенами приводит к уменьшению диэлектрической постоянной приповерхностной зоны.

Кондуктометрические преобразователи регистрируют изменение проводимости раствора в биоселективной мембране и тем самым позволяют наблюдать за ходом биохимических реакций, в том числе ферментативных.

По имеющимся данным, при ферментативных реакциях изменение проводимости может быть обусловлено несколькими факторами — образованием ионных групп, разделением разных зарядов, миграцией протонов, изменением степени ассоциации ионов и изменением размеров заряженных групп (таблица).

 

Таблица. Факторы, приводящие к изменению проводимости

Источник изменения проводимости Примеры ферментов
Генерация ионных групп Амидазы
Разделение разных зарядов Дегидрогеназы и декарбоксилазы
Миграция протонов Эстеразы
Изменение степени ассоциации ионных частиц Киназы
Изменение размеров заряженных групп Фосфатазы и сульфатазы

 

Самыми «влиятельными» считаются первые два фактора: образование ионных групп, как и разделение разных зарядов, сопровождается наиболее значительными изменениями проводимости. Но бывает, что действием какого-либо одного фактора дело не ограничивается. К примеру, в реакциях с фосфорилазой ответственность за изменение проводимости лежит одновременно на двух факторах — миграции протонов и изменении размеров заряженных частиц. И эти же два фактора плюс образование ионных групп вызывают значительные изменения проводимости в реакциях с апиразой.

Объективности ради надо заметить, что кондуктометрические биосенсоры применяются не только для наблюдения за биохимическими реакциями. Иногда их используют для определения концентрации какого-либо субстрата (к примеру, мочевины). Иногда — в качестве мультисенсоров для одновременного тестирования нескольких субстратов (к примеру, мочевины, L-аспарагина и креатинина).

Прошлое, настоящее, будущее

В 1962 году на симпозиуме Нью-Йоркской Академии Наук профессор Леланд Кларк поделился с коллегами своей идеей создания принципиально нового, по его выражению, более разумного электрохимического датчика, дополненного ферментным преобразователем в виде мембранного сэндвича. И не просто поделился, а проиллюстрировал ее экспериментальными данными по включению фермента глюкооксидазы с использованием диализной мембраны в кислородный электрод. Несколько позже появились и неоспоримые доказательства «высокой разумности» так называемого ферментного электрода: он оказался вполне пригодным для определения уровня глюкозы, чем не преминула воспользоваться фирма Yellow Spring Instruments (Ohio, USA), выпустив первый рабочий анализатор глюкозы на основе амперометрического определения перекиси водорода. Правда, не сразу, а лет через десять, в 1973 году.

Несколько лет спустя фирма Miles, отталкиваясь от экспериментов Клеменса по введению электрохимического биосенсора в искусственную поджелудочную железу, разработала устройство под названием биостатор. Фирма VIA Medical (San Diego) — глюкозный анализатор крови на основе катетера, работающий в полунепрерывном режиме. А фирма La Roche (Switzerland) — анализатор лактата LA 640, где в роли переносчика электронов от лактат-дегидрогеназы к электроду выступал растворенный медиатор гексацианоферрат.

В те же 70-е годы Лубберс и Опитц описывают волоконно-оптический сенсор для измерения окиси углерода и кислорода и вводят термин «оптрод». Несколько позже они, используя иммобилизованную алкогольоксидазу, создадут еще один оптический биосенсор для определения алкоголя. Однако коммерческого применения ферментные оптроды не найдут. (Не в пример биосенсорам, предназначенным для измерения рН, рСО2 и рО2 in vivo, которые сегодня широко используются во многих странах.)

Практически одновременно с Лубберсом и Опитцем Дывис показывает, что на роль биоэлементов прекрасно подходят бактерии, а созданные на их основе микробиальные электроды можно применять для определения этанола. (Японские исследователи, взяв за отправную точку работу Дывиса, на основе микробиальных сенсоров впоследствии создадут эффективную систему мониторинга загрязнения водоемов.)

В начале 80-х в целом ряде работ будет доказана возможность применения медиаторов оксидоредуктаз — ферроцена и его производных — при создании недорогих ферментных электродов. Тогда же Лидберг предложит технологию промышленного производства прямого иммуносенсора — пьезоэлектрического потенциометрического датчика с фиксированными на нем антителами. Через несколько лет эти наработки найдут коммерческое применение: в 1987 году фирма MediSense (Cambridge, USA) на основе ферментных электродов, изготовленных по технологии печатных плат, наладит производство компактных персональных глюкосенсоров, а в 1990 году фирма Pharmacia (Sweden) на основе технологии Лидберга начнет выпуск коммерческих иммуносенсоров — Биакор, значительно упростивших и ускоривших процедуру иммунохимического анализа. Несмотря на высокую стоимость, Биакор найдет широкое применение в научной и клинической практике. Однако исследователи не остановятся на достигнутом. Работы над снижением стоимости популярного иммуносенсора будут продолжены, в том числе и отечественными учеными из Института полупроводников НАН Украины, которым удастся разработать дешевый аналог этого устройства. В конце 90-х, используя оптические подходы, специалисты создадут еще один иммуносенсор, способный определять в анализируемой жидкости, как минимум, сотню молекул. Примерно тогда же активизируются исследования по разработке биосенсоров с оптическими, пьезоэлектрическими и электрохимическими преобразователями на основе информационных молекул ДНК и РНК. (Иными словами, биосенсоров, способных обеспечить экспресс-анализ генетических и онкологических заболеваний, микробных и вирусных инфекций.)

Во втором квартале следующего года компания Matsushita Electric Industrial Co., известная широкой публике продукцией под маркой Panasonik, обещает сделать коммерчески доступной высокопроизводительную биосенсорную технологию тестирования лекарств под названием Drugmining. Сейчас технология Drugmining, позволяющая производить до ста тысяч измерений в день с целью исследования эффективности лекарств в среде, близкой по составу к биологической среде человеческого организма, проходит испытания.

Что касается медицины, то здесь на очереди создание биосенсоров, заменяющих рецепторы живых организмов. По мнению ученых, такой подход позволит создать «искусственные органы» обоняния и вкуса, а диагностику целого ряда заболеваний сделать более точной и информативной.

Составляющие успеха

Что позволяет биосенсорным системам столь успешно конкурировать с давно привычными биохимическими, физическими и химическими методами анализа? На взгляд специалистов, причин тому несколько.

Прежде всего, практически неисчерпаемые ресурсы хорошо изученной «биоэлементной базы». К тому же биологически активный материал (а это ферменты, рецепторы, ДНК, нуклеиновые кислоты, микроорганизмы и ткани) хорошо изучен, а стоимость его (т. е. биологического материала) выделения, очистки и иммобилизации постоянно снижается.

К числу несомненных достоинств биосенсоров несомненно относится их способность преобразовывать самые различные виды энергии, высокая избирательность и не менее высокая чувствительность: все эти качества позволяют использовать биологические устройства для обнаружения и определения содержания ионных примесей, простых и сложных неорганических и органических молекул в воздухе, воде и даже многокомпонентных жидкостях. Немаловажно, что иммобилизованный биологический элемент можно нанести на поверхность любого преобразователя и использовать многократно, поскольку он легко отмывается от остатков реакционных смесей. Кроме того, на основе гибридных биофизических модулей можно создавать быстродействующие аналоговые устройства для изучения биохимических процессов в режиме реального времени.

Вдобавок ко всему при проведении биосенсорного анализа не возникает потребности ни в дорогостоящем сложном оборудовании, ни в высокооплачиваемом высококвалифицированном персонале. И это при относительно низкой стоимости физических преобразователей (естественно, при условии их массового производства).

Стремительная коммерциализация биосенсоров началась почти через тридцать лет после того, как профессор Леланд Кларк вынес на суд коллег свою концепцию. В 1993 году выручка от продаж биосенсорных устройств составила 150 млн долларов. Год спустя — 200 млн долларов. Еще через три года сумма продаж перевалила за миллиард. К 2000 году — удвоилась. Но это не предел. Сегодня только в США над созданием биосенсоров работает около 150 компаний. Не менее активно разработкой биосенсоров занимаются и в странах Западной Европы, где на финансирование научно-исследовательских и исследовательско-конструкторских работ выделяются значительные средства из госбюджета. Главным образом, в виде пятилетних грантов, предназначенных для разработки биосенсорных технологий. Но самую мощную финансовую подпитку биосенсорика получает в Японии. И это себя оправдывает: на рынке биосенсорных устройств Япония, благодаря постоянным финансовым вливаниям и тесному кооперированию частных компаний с государственными организациями, стала основным конкурентом для большинства высокоразвитых стран. Хотя абсолютным лидером на рынке по-прежнему остается американская фирма Mеdisense (Abbort Laboratories), специализирующаяся на производстве глюкосенсоров для лабораторного и персонального использования.

Тем не менее, даже в относительно благополучных странах коммерческий успех уготован далеко не всем разработкам. Большей частью дело ограничивается созданием действующих лабораторных макетов.

Прежде всего, по причине недостаточного финансирования научно-исследовательских и исследовательско-конструкторских работ и невозможности передачи разработанных технологий компаниям-производителям. Кроме того, широкое практическое внедрение требует четкого определения сферы применения и стоимости микросенсоров, обоснованного прогнозирования величины потенциального рынка и оценки преимуществ биосенсоров в сравнении с существующими методами анализа. Такова, на взгляд специалистов, экономическая сторона вопроса. Помимо этого, по мнению тех же специалистов, успешная коммерциализация биосенсоров требует решения некоторых технических проблем:

  • обеспечения условий создания и интеграции биомембран с поверхностью физического преобразователя в одном технологическом цикле;
  • обеспечения стабильного функционирования биосенсора в различных условиях;
  • решение проблемы влияния интерферирующих веществ на работу сенсора;
  • адаптации лабораторных технологий к массовому производству дешевых, надежных и высокочувствительных биосенсоров;
  • создания так называемых in vivo сенсоров, т. е. сенсоров, способных в течение длительного времени функционировать непосредственно в живом организме.

Однако, несмотря на проблемы, в высокоразвитых странах коммерциализация биосенсоров пусть не так быстро, как хотелось бы специалистам, но все-таки растет.

Биосенсорика в Украине

По уровню научно-исследовательских работ Украина, безусловно, стоит в одном ряду с мировыми лидерами в области биосенсорики — Японией, США, Англией, Германией и Францией. Подтверждение тому — многочисленные публикации наших ученых в ведущих международных журналах, презентации на международных форумах, получение международных грантов и стипендий, приглашение украинских специалистов в различные зарубежные лаборатории.

Если же говорить более конкретно, то именно в Украине была разработана уникальная технология получения рН-чувствительного полевого транзистора с необходимыми для сенсора характеристиками. (Кстати говоря, и сейчас, по прошествии десяти лет, украинские полевые транзисторы по своим параметрам превосходят практически все ныне существующие зарубежные аналоги.)

Кроме того, только в Институте молекулярной биологии и генетики НАН Украины, которым руководит академик НАНУ Анна Валентиновна Ельская создано около двадцати лабораторных макетов потенциометрических и кондуктометрических биосенсоров. За исключением высокоселективного сенсора на основе генетически модифицированных клеток метилотрофных дрожжей для определения концентрации метанола, этанола и формальдегида, разработанного в содружестве со специалистами Львовского отделения регуляторных клеточных систем Института биохимии НАН Украины, все остальные микросенсоры — ферментные. По замыслу разработчиков их можно использовать в самых различных областях.

Есть среди них биосенсоры, позволяющие точно и быстро определять содержание глюкозы, мочевины и ацетилхолина в биологических средах. Их целесообразно применять в медицинской диагностике. Есть микросенсоры, способные уловить даже незначительное загрязнение водных растворов фосфорорганическими пестицидами, гипохлоритом, ионами тяжелых металлов, цианидами и цианидсодержащими гликозидами. Предполагаемая сфера их использования — экология. Есть и микросенсоры, предназначенные для анализа глюкозы, пенициллина, станола и интерферона. Их можно применять в контроле биотехнологических процессов.

Но все это в перспективе. Пока же параллельно с созданием новых биосенсоров киевляне в содружестве с учеными Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины во главе с академиком НАНУ Валентином Ивановичем Грищенко занялись решением важнейшей сопутствующей проблемы — проблемы хранения биологических датчиков.

Дело в том, что практикуемое сегодня хранение при относительно высоких температурах — будь то комнатная температура или температура бытового холодильника, неважно — не обеспечивает достаточно длительной сохранности биологических датчиков. Вопросами же низкотемпературного консервирования сенсоров практически никто не занимается, хотя, по словам заведующего отделом криобиофизики, кандидата физико-математических наук Олега Анатольевича Нардида, именно криоконсервирование может существенно увеличить сроки их хранения.

Разработка технологии низкотемпературного хранения гибрида биологического и физического компонентов — дело непростое, требующее поэтапного подхода.

Начальным этапом для харьковских биофизиков стал подбор оптимальных режимов замораживания-оттаивания для физических преобразователей двух типов — рН-чувствительных полевых транзисторов и тонкопленочных кондуктометрических электродов.

Преобразователи — системы довольно сложные. Состоят они из нескольких элементов с различными физическими параметрами элементов. У каждого элемента — будь то поверхность преобразователя, защитный слой или электродные гребенки — при неудачном выборе режимов есть шанс приобрести значительные повреждения.

Судя по данным исследований, первый шаг оказался удачным: исследователям удалось найти щадящие режимы замораживания. Для преобразователей с силиконовым защитным слоем — это медленное (т. е. 3°С/мин) охлаждение до температуры жидкого азота. Для преобразователей с защитным слоем из эпоксидного лака — быстрое (т. е. 300°С/мин) замораживание с предварительной обработкой поверхности 25% раствором глицерина. (Этот раствор, к слову сказать, добавляется при формировании абсолютно всех типов биоселективных мембран для защиты от растрескивания и существенного улучшения адгезии к поверхности физического преобразователя.)

Что же касается коммерциализации биосенсоров, то здесь дела обстоят не просто плохо, а очень плохо. Ни один из отечественных биосенсоров, как отмечает один из фундаторов отечественной биосенсорики, академик НАНУ Анна Валентиновна Ельская, до сих пор не запущен в массовое производство. «Жаль,— добавляет Анна Валентиновна,— за счет коммерциализации можно было бы насытить внутренний рынок и получать прибыль от экспорта».





© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика