Логотип журнала "Провизор"








Рецепты на все случаи жизни

Л. В. Львова, канд. биол. наук

По прогнозу руководителя программы «Геном человека» доктора Ф. Коллинза через каких-то семь лет генная терапия будет применяться для лечения 25 наследственных заболеваний. К 2020 году при помощи технологии гомологичной рекомбинации будет продемонстрирована безопасность генотерапии на уровне зародышевых клеток. К 2040 году для генной терапии будет доступно большинство заболеваний, а вместо лекарств больным будут назначаться продукты генов, вырабатываемые организмом в ответ на генотерапию.

Рецепт № 1

Любое нейродегенеративное заболевание обусловлено повреждением вполне определенных отделов центральной нервной системы: при болезни Альцгеймера это неокортекс, гиппокамп и субкортикальные ядра, при болезни Паркинсона — дофаминэргическая система (главным образом, нигростриатная), а при болезни Хантингтона — стриальные нейроны. Вне зависимости от локализации, дегенерация нервных клеток всегда приводит к дисбалансу в синтезе нейромедиаторов. Возникший дисбаланс — будь-то недостаточный синтез дофамина, как при болезни Паркинсона, или недостаточный синтез γ-аминомасляной кислоты, как при хорее Хантингтона — вызывает сбои в регуляторной деятельности центральной нервной системы и, как следствие,— нарушение координации движений, умственных и мыслительных способностей.

В развитии нейродегенеративных заболеваний, как недавно выяснилось, активно участвуют генетические факторы.

К примеру, одной из причин болезни Паркинсона считаются мутации в гене α-синуклеина. Болезнь Альцгеймера связывают с мутациями в гене белка-предшественника b-амилоида: из-за неспособности мутантного гена обеспечить нормальное продуцирование белка-предшественника формирование нейрофибрилл нарушается. В результате нервные клетки гибнут, а синтез нейромедиаторов резко уменьшается.

Традиционные методы лечения нейродегенеративных заболеваний — фармакотерапия и нейрохирургические вмешательства дают относительно кратковременный положительный эффект. К сожалению, не оправдала надежд и клеточная терапия с использованием эмбрионального материала: вопреки ожиданиям в большинстве случаев пересадка эмбриональных нейронов приносит больному лишь временное улучшение. Выход из сложившейся ситуации специалисты видят в генно-клеточной терапии. Попросту говоря, трансплантации эмбриональных клеток, предварительно «нагруженных» генетическими конструкциями.

При таком подходе перед пересадкой в культуру эмбриональных нейронов, полученную из необходимой для пересадки области нервной системы, вводят конструкцию, несущую либо ген ростового фактора, либо ген фермента, влияющего на синтез нейромедиатора. К примеру, при паркинсонизме для компенсации недостатка синтеза дофамина в клетки вводят ген тирозингидроксилазы, катализирующей превращение тирозина в L-дофа.

Сходный подход применим и по отношению к стволовым клеткам. Только гены в этом случае используются другие — ответственные за синтез сигнальных молекул, управляющих дифференцировкой стволовых клеток по нейрональному типу.

Некоторые исследователи для лечения паркинсонизма предлагают использовать собственные клетки больного. До клинических испытаний дело пока не дошло. Но эксперименты на животных уже ведутся. Результаты этих опытов свидетельствуют о том, что имплантация в мозг «родных» клеток кожи, предварительно трансфецированных геном тирозингидроксилазы, улучшает состояние у 40% крыс с расстройствами центральной нервной системы по типу болезни Паркинсона.

Еще одна генно-клеточная технология предполагает трансплантацию глиальных клеток, «нагруженных» генами ростового фактора. По имеющимся данным, введение гена нейронального ростового фактора в культуру астроцитов человека позволяет значительно — до 41 нг в день на тысячу клеток — повысить секрецию биоактивного ростового фактора. Вполне вероятно, что повышение уровня ростового фактора положительно скажется на выживаемости нейронов и тем самым продлит терапевтический эффект трансплантации.

Несколько лет назад в специальной литературе появилось сообщение о довольно экзотическом способе лечения больных амиотрофическим латеральным склерозом с использованием почечных клеток детенышей хомячка. Суть лечения состоит в следующем.

Выделенные клетки предварительно трансфецируются вектором, несущим ген цилиарного нейротрофического фактора. Затем генетически модифицированные клетки помещаются в полимерные капсулы и трансплантируются в люмбарное интратекальное пространство.

Судя по результатам анализов, после пересадки активность нейротрофического фактора сохраняется в спинномозговой жидкости больных достаточно долго. Но, несмотря на это, излечение не наступает.

Наряду с разработкой генно-терапевтических методов лечения нейродегенеративных заболеваний ученые занимаются изучением возможности классических систем адресной доставки.

В частности, при болезни Хантингтона предлагается использовать антисмысловые последовательности нуклеотидов. А при болезни Паркинсона — гены, способные скорректировать заболевание.

На моделях животных с паркинсонизмом уже удалось доказать, что инъекция векторов на основе аденоассоциированных вирусов, несущих ген тирозингидроксилазы в стриатум, инициирует синтез этого фермента de novo: главным образом, в нейронах, и частично — в глиальных клетках. А после инъекции аденовирусного вектора, содержащего ген нейротрофического фактора глиальных клеток человека, у больных крыс нормализуется синтез дофамина, улучшаются двигательные и поведенческие реакции.

Рецепт № 2

По самым скромным подсчетам, около 80% всех нынешних протоколов генной терапии приходится на злокачественные новообразования. Причин тому несколько. Прежде всего — огромное число онкозаболеваний, лечить которые сложно, а зачастую и просто невозможно. К тому же, когда речь заходит о тяжелых (и нередко безнадежных) онкологических больных, мысли о возможности отдаленных генетических нарушениях отходят на второй план. Особенно, если вспомнить о последствиях массированного облучения и химиотерапии, столь широко и не всегда эффективно используемых при лечении рака.

Один из способов увеличения эффективности традиционного лечения — повышение восприимчивости опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам. Суть его состоит в введении в опухолевые клетки генов, кодирующих ферменты, наделенные способностью трансформации химических соединений из слаботоксичной в высокотоксичную форму. Обычно это ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-TK): тимидинкиназа избирательно фосфорилирует синтетический нуклеозидный аналог ганцикловир, который затем весьма эффективно подавляет синтез ДНК. Любопытно, что если поблизости от уже существующей обычной опухоли ввести определенное количество модифицированных таким образом опухолевых клеток, то ганцикловир вызовет ее (т. е. опухоли) регрессию. Это явление, обнаруженное в опытах на животных и названное «эффектом присутствия», обусловлено, по-видимому, иммунными механизмами. Наблюдается ли «эффект присутствия» у людей, неизвестно. Но клинические испытания метода уже ведутся. Объектов исследования несколько: плевральная мезотелиома, рак яичников и опухоль мозга — глиобластома.

Помимо этого в 1999 году получил одобрение протокол лечения рака предстательной железы, предполагающий инъекционное введение в железу больного генетической конструкции, включающей ген HSV-TK, и одновременное введение ганцикловира в кровь. В ходе испытаний удалось не только подобрать безопасные дозы, но и продемонстрировать положительный терапевтический эффект.

Объективности ради замечу, что не менее интенсивно генотерапевты работают и над другими методами лечения рака. Это повышение иммунореактивности опухоли и генетическая модификация иммунных клеток с целью усиления их противоопухолевой активности, индукция синтеза противоопухулевых веществ нормальными клетками и блокирование экспресссии онкогенов (к примеру, с помощью антисмысловых конструкций или внутриклеточных антител), введение в раковые клетки генов-супресоров опухолей (к примеру, гена белка р53 «дикого» типа) и защита нормальных клеток от токсического действия химиотерапевтических препаратов (к примеру, путем введения в стволовые клетки костного мозга гена множественной лекарственной устойчивости), локальная радиопротекция нормальных тканей за счет гиперэкспрессии в них генов антиоксидантов (к примеру, генов глутатион-синтетазы или трансферазы), создание противоопухолевых рекомбинантных вакцин и введение в опухоль генов, повышающих восприимчивость к химиотерапевтическим препаратам (так называемых «генов-самоубийц»).

Рецепт № 3

Семейная гиперхолестеринемия — заболевание наследственное. Обусловлено оно различными дефектами гена, локализованного на девятнадцатой хромосоме и ответственного за синтез мембранных рецепторов к липопротеидам низкой плотности (ЛНП) — «перевозчикам» пищевого, атерогенного холестерина в кровотоке.

Львиная доля (75%) ЛНП-рецепторов сосредоточена на поверхности гепатоцитов.

Их основная физиологическая функция — удаление липопротеидов в печень: там избыточный холестерин превращается в желчные кислоты, которые затем через кишечник выводятся из организма.

При наличии в гене дефектов — будь то делеции, ингибирующие синтез матричной РНК и белка, или точечные мутации, ведущие к синтезу функционально неполноценного рецептора — уровень липопротеидов низкой плотности в крови возрастает. Если в норме в липопротеиды низкой плотности (ЛНП) превращается только половина липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), то при патологии все ЛОНП успевают трансформироваться в ЛНП, которые остаются циркулировать в кровотоке. По этой причине большее количество частиц ЛНП фильтруется в интиму артерий. В интиме часть из них преобразуется в модифицированные частицы (мЛНП), некоторые из которых инициируют формирование новых антигенов и стимулируют их представление макрофагами. Активизированные макрофаги вызывают развитие в эндотелии воспалительной и иммунной реакций. На поверхности эндотелиальных адгезинов и клеток, контактирующих с кровью, усиливается экспрессия генов, кодирующих молекулы адгезии — ICAM, VCAM, E-selectins. Активация медиаторов хемотаксиса способствует притоку все новых и новых «порций» моноцитов и лимфоцитов. Избыточный синтез внеклеточных цитокинов и ростовых факторов провоцирует развитие фиброза сосудистой стенки и липоидоза — отложения частиц ЛНП и мЛНП. Этот процесс, снова и снова повторяясь в интиме, в конце конков приводит к нерегулируемому росту склеротической бляшки.

Таков в общих чертах механизм формирования коронарного атеросклероза, обусловленного мутациями гена ЛНП-рецепторов.

Однако гетерозиготная и гомозиготная формы семейной гиперхолестеринемии развиваются по разным сценариям.

У пациента, гетерозиготного по дефектному гену вследствие двукратного уменьшения числа активных ЛНП-рецепторов, вдвое возрастает уровень липопротеидов низкой плотности в крови, развивается ишемическая болезнь сердца и уже в первой половине жизни ему грозит коронарный атеросклероз с инфарктом миокарда. По статистике, гетерозиготная гиперхолестеринемия — удел каждого пятисотого жителя Земли. Такой пациент до конца жизни обречен на прием ловастатина: селективно повышая уровень ЛНП-рецепторов в печени, ловастатин тем самым на 20-60% снижает содержание в крови липопротеидов низкой плотности. Прекращение приема препарата чревато трехкратным повышением холестерина в плазме крови. Но, как известно, ловастатин подходит далеко не всем: около половины больных его плохо переносят.

У пациентов-гомозигот (а это каждый миллионный землянин) уровень холестерина в крови достигает 1000 мг/дл. В 15-25 лет у них развивается тяжелый коронарный атеросклероз, который обычно имеет летальный исход. Единственный способ продлить жизнь больного — трансплантация печени, восстанавливающая нормальный круговорот пищевого холестерина в организме. Но вся беда в том, что функционирует пересаженная печень недолго: один, максимум, два года.

В поисках эффективных способов лечения ученые обратились к генотерапии.

Первые схемы генокоррекции предполагали шприцевые инъекции ген-модифицированных гепатоцитов непосредственно в печень.

Для этого больному под наркозом проводилось иссечение трети печени. Примерно третья часть из выделенных таким образом десяти миллиардов гепатоцитов терялась на этапе изолирования и получения первичной культуры. Оставшиеся семь миллиардов клеток модифицировались с использованием аденовирусного вектора, «начиненного» двумя генами — геном ЛНП-рецептора и геном β-галактозидазы, за активностью которого в гепатоцитах можно было проследить с помощью хромогенного субстрата. В лучшем случае, т. е. при максимальной, 40% трансфекции, в печень ретарансплантировалось около трех миллиардов «подлеченных» клеток. Один-два из ста введенных гепатоцитов приживлялись. Остальные — быстро элиминировались из кровотока и погибали (даже если сразу после операции назначались иммуносупрессоры). Но гиполипидемический эффект все же наблюдался. Правда, недолго — несколько недель: за это время трансфецированные клетки либо погибали, либо переставали функционировать.

Таким методом в США, Канаде, Франции и Англии было пролечено несколько пациентов. Широкого клинического применения эта схема генотерапии не получила. Возможно, более востребованной окажется схема генокорреции, разработанная недавно в США.

Как и предыдущая, новая схема предполагает трансфецирование гепатоцитов in vitro. Но иссекается при этом не треть печени, а всего лишь 15%. Пятая часть выделенных гепатоцитов модифицируется введением гена ЛНП-рецептора с помощью искусственно выведенного и, судя по всему, безвредного вируса. После чего «вылеченные» клетки с помощью катетера вводятся в вену, ведущую непосредственно к печени. По данным малой печеночной биопсии, некоторые ретрансплантированные клетки продолжают нормально функционировать, по меньшей мере, в течение нескольких месяцев. Причем содержание липопротеидов низкой плотности в крови больного снижается почти на треть. Столь явное улучшение, по мнению разработчиков, позволит в дальнейшем снижать уровень ЛНП исключительно лекарственными средствами.

Рецепт № 4

Мальчики, страдающие миодистрофией Дюшена, к десяти годам утрачивают способность двигаться, а в последующие десять лет погибают от нарастающей дистрофии сердечной и легочной мускулатуры.

Традиционным методам лечения это заболевание, обусловленное дефектом гена дистрофина, не поддается. Вся надежда на генотерапию.

Над изучением возможности генно-терапевтического лечения миодистрофии ученые работают уже лет пятнадцать.

В экспериментах на мышах были отработаны различные способы введения гена дистрофина, включая адресную доставку с помощью баллистической трансфекции.

Самое большое достижение — экспрессия интродуцированного гена дистрофина в 25% мышечных волокон. Между тем терапевтический эффект требует генетической модификации минимум половины всех мышечных волокон организма. Возможно, высокоэффективные вирусные конструкции нового поколения позволят добиться необходимого уровня трансфекции. Во всяком случае, генотерапевты на это очень надеются.

В Центральной Европе один из 2500 новорожденных страдает муковисцидозом — моногенным заболеванием, обусловленным мутациями в гене хлорных каналов эпителиальных клеток.

Попытки лечить муковисцидоз генотерапевтическими методами предпринимаются давно. Экспериментальная апробация метода прошла удачно: биохимический дефект у подопытных животных удалось скорректировать введением нормального гена с использованием рекомбинантных аденовирусных векторов или липосом. Чего нельзя сказать о первой стадии клинических испытаний: вдыхание пациентом водно-эмульсионного препарата, содержащего «терапевтический» ген, не дало желаемого результата. Поэтому в дальнейшем для доставки генов предполагается использовать липосомы и катионные липиды.

В общей сложности к сегодняшнему дню в литературе можно найти сведения о разработке экспериментальных подходов и проведении предклинических и клинических испытаний генно-терапевтических методов примерно для трех десятков моногенных заболеваний. Проанализировав эти данные, специалисты пришли к выводу, отсутствие желаемого лечебного эффекта обусловлено несколькими причинами:

  • отторжением чужеродных генов (главным образом, вследствие иммунной реакции организма);
  • угасанием функции индуцированного гена;
  • невозможностью введения «терапевтического» гена в определенный участок хромосомы;
  • недостаточной эффективностью трансфекции.

Рецепт № 5

В последнее время все большее внимание уделяется генотерапии приобретенных заболеваний, не связанных с врожденным дефектом структуры или функции какого-то определенного гена. Существующие ныне методы генокоррекции таких болезней, по сути, сводятся к двум схемам.

Первая схема базируется на введении в организм больного гена, ответственного за синтез белка, который, как предполагается, способен оказывать лечебный эффект. Вторая схема основана на целенаправленном изменении свойств трансфецированных клеток, которое вызывает терапевтический эффект либо само по себе, либо за счет повышения чувствительности клеток к лекарственным препаратам.

При этом поиски оптимального пути генокоррекции ведутся одновременно в нескольких направлениях. Пример тому — генотерапия ревматоидных артритов. Один подход предполагает введение в суставную сумку генов, продукты которых обладают лечебным эффектом. В частности, ген белка-антагониста рецептора интерлейкина-1, помогает предотвратить пролиферацию синовиальных клеток, покрывающих суставную сумку.

Второй подход предусматривает использование антисмысловой конструкции, которая, попадая в суставную сумку, подавляет синтез одного из важнейших провоспалительных факторов — белка Fcappa.

Если говорить о генотерапии сердечно-сосудистых заболеваний, то здесь возможных вариантов лечения гораздо больше.

Первый вариант — генетическая модификация эндотелия кровеносных сосудов. Для этой цели подходят гены белков, способных предотвратить образование тромбов. (Например, ген плазминогена.)

Второй вариант, рассчитанный на обновление сосудистой системы сердечной мышцы после инфаркта миокарда, предполагает введение генов ангиогенеза, продукты которых инициируют процесс образования сосудов.

Третий вариант касается профилактики и лечения атеросклероза путем введения генов, ответственных за синтез липопротеидов высокой плотности, столь необходимых для нормального обмена липидных компонентов крови.

Четвертый вариант тоже имеет отношение к атеросклерозу. Но задача у него иная: воспрепятствовать разрастанию и миграции гладкомышечных клеток сосудистой стенки за счет введения в них генов-супрессоров пролиферации.

Что касается лечения ВИЧ-инфекции, то здесь скепсис в отношении генотерапии постепенно сменяется умеренным оптимизмом. Но какой подход окажется эффективнее: модификация Т-лимфоцитов и макрофагов под воздействием «доминантного негативного» гена revMIO, продукт которого инактивирует функциональную матричную РНК вируса иммунодефицита, или введение антисмыловых конструкций для блокирования генов, кодирующих различные вирусные белки, пока неясно.

Рецепт № 6

Вполне вероятно, что в недалеком будущем на смену привычной вакцинации придет ДНК-иммунизация (т. е. введение в организм генных конструкций, кодирующих нужные белки-антигены). Во всяком случае, так считают приверженцы генной терапии. При этом они не забывают упомянуть об опытах на животных, свидетельствующих о высокой эффективности метода (особенно по отношению к некоторым вирусным инфекциям) и подтверждающих несомненные достоинства ДНК-иммунизации. Прежде всего, это:

  • уменьшение численности отдельных иммунизаций за счет введения рекомбинантного (т. е. построенного из нескольких генов) вектора, способного одновременно управлять синтезом нескольких антигенов;
  • преодоление проблемы проникновения в организм чужеродного белка;
  • снижение риска побочных эффектов, обусловленных токсичностью балластных белков при традиционной иммунизации или вирулентностью бактерий и вирусов, используемых для получения обычных вакцин.

Поначалу ДНК-иммунизацию пытались проводить путем подкожной или внутримышечной инъекции «голой» ДНК. Но продержался такой способ недолго, и вскоре для введения трансгенов стали использовать более эффективную баллистическую трансфекцию. Появилась даже специальная «генная пушка», стреляющая вольфрамовыми или золотыми микрочастицами, покрытыми плазмидной ДНК. Выпущенные из пушки «снаряды» доставляют генные конструкции прямо в клеточные ядра. Однако в ткани они, как правило, проникают неглубоко: примерно на один миллиметр. Поэтому чаще всего обстрел микрочастицами используется для трансфекции клеток кожи и подлежащего хряща. Но при особых условиях обстрела «снаряды» способны проникнуть в ткань на глубину до пяти миллиметров, что вполне достаточно для доставки генов в волокна поперечно-полосатых мышц.

Кстати сказать, «генная пушка» прекрасно зарекомендовала себя в лечении повреждений кожи: введение плазмид, несущих ген фактора роста эпителия, существенно ускоряет заживление ран. Помимо баллистической трансфекции в генотерапии кожных заболеваний применяется еще один эффективный и атравматичный способ доставки генетических конструкций — втирание ДНК в волосяные фолликулы. Кроме того, недавно был разработан генно-терапевтический подход, основанный на имплантации в кожу трансформированных in vitro кератиноцитов.

Рецепт № 7

Можно ли генно-терапевтическими методами продлить молодость?

«В принципе можно,— утверждают специалисты. — Причем несколькими способами. Для усиления антиоксидантной системы защиты стареющего организма можно ввести ген глутатионпероксидазы. Для стимуляции слабеющей с возрастом системы репарации ДНК — гены ферментов, участвующих в восстановлении поврежденных участков ДНК. Вдобавок можно еще «подправить» иммунную систему стареющего организма. Для этого из локуса гистосовместимости нужно вырезать поврежденные гены. С помощью специфических ферментов удалить из них «возрастные» поперечные сшивки ДНК. После чего ввести отремонтированные гены в организм».

Ген теломеразы в перечень «омолаживающих средств» почему-то не входит. (Хотя фермент этот, как недавно выяснилось, может обессмертить клетки: после введения гена теломеразы в клеточную культуру, концевые участки хромосом — теломеры перестают укорачиваться при каждом последующем делении клеток и в результате клетки могут делиться бесконечно долго.) В генотерапии ему найдено иное применение — ген теломеразы планируется использовать в лечении больных циррозом печени. О клинических испытаниях говорить пока рано, но результаты экспериментов на животных обнадеживают: у мышей с экспериментальным циррозом путем введения гена теломеразы удалось добиться восстановления теломеразной активности, что, на взгляд исследователей, может способствовать восстановлению нормального содержания гепатоцитов, а следовательно, и лечению заболевания.

Литература

  1. Угрюмов М. В., Ермаков А. С. и др. Генная и генно-клеточная терапия и нейродегенеративные заболевания // Вопросы медицинской химии.— 2000.— № 3.
  2. Клеточная терапия семейной гиперхолeстеринемии и гиперлипопротеинемии III типа // http://www/ournet.md
  3. Мурзина Т. А., Ермаков А. С., Кривцов Д. Г., Бронова Д. Д., Власов В. В. Перенос функциональных генов в глиальные клетки (невриномы гассерова узла крысы) с помощью хитозанов и холестериновых производных олигоэтиленимина // Тез. докл. «Актуальные проблемы нейробиологии.»—1999.— С. 85-88.
  4. Келли К. С. Введение в генную терапию//http://www.hemophilia.ru
  5. Генная терапия: предупреждение и надежда // Российский медицинский журнал.— 1997.— Т. 5.— № 12.
  6. Баранов Л. Генная терапия // http://www.pereplet/ru




© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика