Логотип журнала "Провизор"








Медицина XXI века?

Л. В. Львова, канд. биол. наук

Генная терапия существует всего несколько десятилетий. Широкого практического применения она пока не нашла. И все же генотерапию часто называют медициной XXI века.

Немного истории

Лет сорок назад обнаружилось, что клетку животного или человека можно заставить продуцировать несвойственный ей белок, встроив в клеточный геном соответствующий ген. Тогда же родилась идея использовать гены для лечения наследственных заболеваний, обусловленных дефектом одного-единственного гена.

Поначалу казалось, что для излечения болезни достаточно заменить мутантный ген или, в крайнем случае, его поврежденный фрагмент на уровне соматических либо зародышевых (половых клеток). Однако по мере накопления экспериментальных данных оказалось, что при всей кажущейся простоте сделать это практически невозможно, а достичь терапевтического эффекта можно и другим способом — введением в организм пациента нормального гена.

В 1983 году именно такой способ был впервые апробирован на практике М. Клайном, попытавшемся лечить больного -талассемией введением нормального -глобулинового гена. Семь лет спустя обнадеживающие результаты были получены в ходе клинических экспериментов по генотерапии рака: у половины больных злокачественной меланомой и поздними стадиями рака после введения в лейкоциты генов, делающих злокачественные клетки узнаваемыми для иммунной системы, размеры опухолей уменьшились как минимум вдвое. Тогда же была предпринята попытка лечения тяжелого, как правило, несовместимого с жизнью иммунологического заболевания, вызванного дефектом гена, кодирующего синтез фермента аденозиндезаминазы.

У девочки, страдающей наследственным иммунодефицитом, выделили клетки костного мозга, перенесли их в культуру и ввели туда нормальный ген аденозиндезаминазы. Потом трансфицированные клетки размножили и ретрансплантировали больной, что способствовало нормализации активности фермента. Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедуру повторяли с интервалом в 3-5 месяцев. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций. Правда, со временем возникли некоторые сомнения в отношении механизмов и стойкости полученного терапевтического эффекта. Тем не менее, именно эта работа дала мощнейший импульс дальнейшему развитию генной терапии и притоку многомиллиардных инвестиций. К 1995 году в мире было реализовано уже сто генотерапевтических проектов. Четыре года спустя число зарегистрированных клинических протоколов генной терапии перевалило за три сотни.

Проблемам генной терапии посвящены шесть престижных международных журналов. Ежегодно проводятся десятки международных конгрессов и конференций. В США созданы десятки центров генной терапии. Во Франции на проблемы генной терапии переориентирован национальный проект «Геном человека». В Германии вопросами генотерапии занимаются в Центре молекулярной медицины им. М. Дельбрюка и Национальном центре по генотерапии.

Тем не менее, об истинном успехе генной терапии говорить пока рано. Судя по оценке ситуации в сфере генотерапии за 1990 -1998 годы, поведенной участниками Международной конференции, организованной шведским Центром по биоэтике и вашингтонским Институтом по биоэтике им. Кеннеди, генотерапевтическое лечение в лучшем случае лишь незначительно и ненадолго улучшает состояние больного. Иногда генокоррекция вообще не дает результата. При этом нередко клинические испытания прерываются из-за серьезных иммуногенных реакций. Однако работы по поиску более эффективных путей генокоррекции продолжаются.

Залог успеха

Сегодня в поле зрения генной терапии несколько десятков заболеваний. И не только моногенных. Есть среди них и мультифакториальные (т. е. обусловленные генетическими и экзогенными факторами), и даже ненаследственные (инфекционные) заболеваний. И, как ни парадоксально, именно генокоррекция приобретенных заболеваний считается сейчас наиболее перспективной. Генотерапия моногенных болезней оказалась намного сложнее, чем предполагалось вначале.

Современная генотерапия подразделяется на позитивную и негативную. В позитивной генотерапии лечебный эффект обеспечивает экспрессия введенного гена. В негативной — торможение гиперэкспрессирующегося или измененного гена.

Генокоррекция может проводиться либо ex vivo (т. е. в культуре клеток), либо in vivo (т. е. непосредственно в организме больного) — все зависит от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента.

На сегодняшний день в подавляющем большинстве программ генной терапии, допущенных к клиническим испытаниям, используется первый подход.

Генокоррекция ex vivo предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них «терапевтических» генов, отбор трансфецированных клеток и их ретратрансплантацию хозяину.

Генокоррекция in vivo основана на прямом введении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного.

По мнению специалистов, ни один из этих методов не имеет явных преимуществ.

Терапия in vivo вроде бы проще. Главное здесь — найти оптимальное «транспортное средство» для доставки гена в клетки больного. При терапии еx vivo все намного сложнее. Во-первых, она сопряжена с манипуляциями по удалению и последующему вживлению генетически модифицированных клеток. Во-вторых, она требует большого объема лабораторной работы: чтобы провести пересадку гена, необходимо вначале проследить за ростом и развитием клетки, подвергнутой трансфекции, и проанализировать полученные данные перед пересадкой.

В-третьих, терапия еx vivo требует индивидуализированного подхода, что с экономической точки зрения, мягко говоря, не очень выгодно. Но в то же время у метода ex vivo есть и свои достоинства. Прежде всего, это касается способов введения генов: в лаборатории для их введения можно использовать довольно простые физические методы, как скажем электропорацию. Попросту говоря, пропустить через клетки электрический ток, тем самым сделав их мембраны проницаемыми для экзогенной ДНК. Кроме того, терапия ex vivo позволяет изолировать и размножить индивидуальные клетки (или клоны) с наиболее желательными характеристиками, а потом ретрансплантировать их больному. Словом, методика еx vivo более трудоемка. Зато она намного безопаснее и легче поддается контролю.

Но вне зависимости от подхода к лечению той или иной болезни, разработке программы генотерапии всегда предшествует большая подготовительная работа по:

  • анализу тканеспецифической экспрессии гена, нуждающегося в коррекции;
  • идентификации первичного биохимического дефекта;
  • исследованию структуры, функции и внутриклеточного распределения белкового продукта дефектного гена;
  • биохимическому анализу патологического процесса.

Все данные, полученные на подготовительном этапе, непременно учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола.

Сама же процедура генокоррекции заболевания апробируется на первичных культурах клеток больного, в которых в норме функционально активен данный ген. При этом оценивается эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяется экспрессия вводимой генетической конструкции, анализируется ее взаимодействие с клеточным геномом и отрабатываются способы коррекции на биохимическом уровне.

Однако использование культуры клеток позволяет лишь разработать систему адресной доставки рекомбинантных ДНК. Проверить ее надежность можно только на организменном уровне, т. е. в опытах на естественных (или искусственно полученных) моделях болезней у животных. Для получения разрешения на клинические испытания в экспериментах на животных необходимо доказать, что нужный ген действительно может быть перенесен в соответствующие клетки-мишени без каких-либо неблагоприятных последствий для пациента и что в этой новой среде перенесенный ген не утратит своей экспрессии и будет функционировать в течение длительного времени.

Короче говоря, стандартная схема генокоррекции — процесс многостадийный.

Первая стадия — это создание полноценно функционирующей (по выражению генетиков, экспрессирующейся) генетической конструкции, состоящей из двух частей: смысловой (т. е. кодирующей белок) и регуляторной части гена.

Вторая стадия — поиск «транспортировщика», способного осуществить эффективную, а еще лучше адресную доставку этой экзогенной ДНК в клетки-мишени. Третья стадия — трансфекция (т. е. перенос полученной конструкции) в клетки-мишени, оценка ее эффективности и степени корригируемости первичного биохимического дефекта in vitro (т. е. в культуре клеток) и in vivo (т. е. в опытах на животных). После этого наступает черед четвертой, заключительной стадии — выполнения программы клинических испытаний.

В поисках идеала

Идеальное «транспортное средство» по доставке необходимого генетического материала в клетки-мишени, на взгляд специалистов, должно быть безопасным, надежным и одновременно дешевым. Оно не должно разрушаться в кровяном русле, быть «невидимым» для иммунной системы и не вызывать воспалительных процессов. Оно должно обеспечить доставку достаточного объема генетической информации в клетки, нуждающиеся в генокоррекции, и вдобавок гарантировать трансформацию заданного количества клеток. К сожалению, ни одно из имеющихся на сегодняшний день «транспортных средств» полностью этим требованиям не удовлетворяет.

Чаще всего транспортировка фрагмента ДНК, содержащего необходимый ген, осуществляется с помощью генетических конструкций (так называемых векторов), созданных на основе патогенных, иногда даже смертельных для человека, вирусов.

Главным образом, ретровирусов и аденовирусов (т. е. вирусов простуды). (Из более 175 уже одобренных протоколов клинических испытаний по генотерапии более 120 предполагают использовать вирусную трансдукцию. Около ста из них основаны на применении ретровирусных векторов.) Несколько меньшей популярностью пользуются аденоассоциированные вирусы и вирус простого герпеса 1-го типа. В некоторых случаях в ход идут гибридные вирусные конструкции на основе вируса простого герпеса и аденоассоциированного вируса и лентивирусы, в том числе и славно известные вирусы иммунодефицита человека.

В интересах безопасности все эти вирусы, различающиеся по способности встраиваться в клеточный геном и по тропизму к определенным тканям и органам, подвергаются генетической модификации, которая сводится к удалению нуклеотидных последовательностей, ответственных за размножение. После чего в обезвреженный вирус встраивается ген, который он должен доставить в клетку-мишень.

Каждый из используемых векторов имеет свои достоинства и недостатки.

Взять хотя бы аденовирусные векторы.

Имея двухцепочечную ДНК, они могут переносить в клетки-мишени чрезвычайно большой объем полезной генетической информации. Но встраиваться в клеточные хромосомы аденовирусы не способны, и доставленные с их помощью гены функционируют за пределами генома. Так длится до тех пор, пока клетки не начинают делиться: в процессе деления введенная генетическая информация элиминируется. Посему для транспортировки генов в клетки с высокой митотической активностью аденовирусные векторы не подходят. Другое дело, неделящиеся клетки или клетки с низкой митотической активностью. Здесь аденовирусы прекрасно себя зарекомендовали. Особенно при доставке генетической информации в нейроны и клетки дыхательных путей. (В последнем случае они обеспечивают более чем 50% трансфекцию. А это означает, что по эффективности аденовирусы на порядок превосходят ретровирусы.)

Кстати сказать, именно с аденовирусным вектором связана трагическая история четырнадцатилетней давности. В Пенсильванском университете восемнадцатилетнему юноше с тяжелейшим генетическим заболеванием — недостаточностью по гену орнитин-трансаминазы — в составе аденовирусного вектора был введен «терапевтический» ген. Через несколько часов у больного наступил общий тромбоз сосудов, и вскоре он умер.

Этот случай получил широкую огласку. На какое-то время все работы по генной терапии фактически были свернуты. Но потом удалось доказать, что причиной смерти являются не специфические последствия генной терапии, а медицинское осложнение неизвестной природы, и генотерапевтические исследования возобновились.

Но вернемся к самым популярным векторам, созданным на основе ретровирусов.

Своим названием семейство ретровирусов, образованное РНК-вирусами, обязано уникальному характеру репродукции. При классической репродукции информация передается от ДНК к РНК. У ретровирусов, наоборот, вирусный РНК-геном вначале переписывается на ДНК. Этот механизм, получивший название обратной транскрипции (на английском «reverse transcription»), и послужил поводом для наименования целого вирусного семейства. К нему принадлежит и подсемейство «медленных вирусов» (по латыни — лентивирусов), в число которых входят и возбудители СПИДа — вирусы иммунодефицита человека.

Все члены семейства ретровирусов наделены способностью проникать в любые клетки и легко встраиваться в клеточные геномы. Большинство из них являются прекрасными «транспортировщиками» чужеродной ДНК в делящиеся клетки. Но для доставки генетической информации в миоциты, нейроны, клетки печени и легких они не годятся. За исключением вирусов иммунодефицита человека и всех остальных представителей немногочисленного подсемейства лентивирусов.

Без труда встраивает экзогенную ДНК в клетки нервной ткани и печени вектор, созданный на основе вируса простого герпеса 1-го типа.

Объективности ради, нельзя не отметить, что вирусные векторы используются не только для доставки «лечащих» генов, но и генетической информации иного рода: задача подобных генетических конструкций — воспрепятствовать нормальной работе матричной РНК, кодирующей белок, синтез которого планируется подавить. Для этого синтезируется комплиментарная цепь нуклеотидов (так называемая антисмысловая РНК), которая, связываясь с матричной РНК, не позволяет ей функционировать в качестве матрицы для синтеза белка.

На первый взгляд ничего сложного в таком методе нет. Но простота эта кажущаяся: на самом деле достаточно сложно добиться, чтобы используемая конструкция была неуязвима для ферментов-нуклеаз и легко (причем в необходимом количестве) попадала в клетку, а комплекс, образованный с матричной РНК, оставался стабильным в течение длительного времени. В противном случае ни о каком терапевтическом эффекте не может быть и речи.

Будут ли в будущем вирусные векторы использоваться в качестве «транспортных средств», сказать трудно. Во-первых, их массовое производство — дело непростое и дорогостоящее. Во-вторых, у вирусов зачастую отсутствует тканевя специфичность. В-третьих, удаление части генома исключает возможность размножения, но не риск опухолеродных мутаций. В-четвертых, введение вирусных препаратов может вызывать нежелательную иммунную реакцию. Вдобавок ко всему существующие векторные конструкции не обеспечивают стабильной интеграции и регулируемой экспрессии введенного гена. Решение этих проблем ученые видят в усовершенствовании генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем и создании векторов на основе искусственных хромосом млекопитающих. (Такие хромосомы, имея в своем составе основные структурные элементы, способны длительно персистировать в клетке. К тому же они могут нести полноразмерные гены вместе с их естественными регуляторными элементами, столь необходимыми для нормального функционирования гена в нужной ткани и в нужное время.)

Конечно, при особом желании можно обойтись и без сложных генетических конструкций: ДНК сама по себе обладает способностью самостоятельно проникать в клетку и встраиваться ее геном. Только случается это крайне редко. По некоторым данным, из миллиона молекул «голой» ДНК в клеточный геном встраивается лишь одна, чего для терапевтических целей явно недостаточно. Для повышения эффективности трансфекции ДНК решили вводить в комплексе с различными соединениями. Самыми перспективными оказались природные катионные белки — гистон Н1, галактозилированный гистон Н1, гистон Н4 в комплексе с ДНК и трансферрин-полилизиновым конъюгатом, а также синтетические полимеры — полиэтиленимин, полилизин, липополилизин и его конъюгаты с трансферрином, асиалоорозомукоидом, неогликопротеином, галактозой и маннозой.

По наблюдениям исследователей, богатые лизином пептиды и белки обладают большим сходством со специфическими сигнальными последовательностями, ответственными за внутриклеточный транспорт (что, по-видимому, облегчает проникновение ДНК из цитоплазмы в ядро). Полисахариды и белки, включенные в состав комплексов, определяют их сродство со специфическими рецепторами на поверхности клеток. В целом взаимодействие таких комплексов с клетками-мишенями очень напоминает проникновение в клетку вирусных частиц.

Иногда для доставки экзогенной ДНК используются липосомы. В сравнении с вирусными векторами ДНК-липидные комплексы обладают целым рядом преимуществ. В первую очередь это больший объем переносимой генетической информации, крайне низкая вероятность инициации иммунного ответа или воспалительной реакции, невозможность приобрести инфекционные свойства вследствие рекомбинации, простота и дешевизна приготовления.

Определенные надежды специалисты возлагают на фосфолипиды. В частности, на кардиолипин и фосфатидилэтаноламин: они способны инициировать слияние мембран, поскольку наряду с бислойными мембранами образуют еще инвертированные мицеллярные структуры, известные как кубические и гексагональные фазы. В присутствии катионов кальция или магния комплексы ДНК с фосфолипидами приобретают дополнительную прочность. Липосомы агрегируют, и ДНК проникает в везикулы (интернализуется во внутренний объем везикул). Однако уровень трансфекции в этом случае оставляет желать лучшего. Повысить его, по-видимому, можно за счет использования высокомолекулярных катионных посредников, обеспечивающих формирование комплексов ДНК с фосфолипидами и взаимодействие этих комплексов с клеточными мембранами.

Настоящей сенсацией стало использование первого низкотоксичного катионного липида 1,2-диолеил-3-N, N, N-триметиламинопропана (ДОТМА), синтезированного Фелгнером: с внедрением в практику ДОТМА по эффективности генетической трансформации клеток липосомальные препараты фактически сравнялись с вирусными векторами. По этой причине даже появился новый термин «липофекция». Но липофекция оказалась эффективной только в прикрепленной культуре клеток: многие из ныне существующих катионных липидов инактивируются в плазме крови. Кроме того, в некоторых органах существует эндотелиальный барьер, препятствующий проникновению липосом.

И все-таки ученые нашли выход. Для значительного увеличения времени циркуляции липосом в кровяном русле они предлагают использовать высокополимерные покрытия, к примеру, полиэтиленгликолевые, которые делают липосомы невидимыми для иммуноглобулинов. Для обеспечения адресной доставки они рекомендуют наносить на поверхность липосом антитела к клеткам-мишеням или специфические клеточные рецепторы (например, рецепторы фолата — маркера опухолевых клеток). А для эффективного впрыскивания ДНК в цитоплазму — размещать на поверхности липосом вирусные белки слияния.

Кстати сказать, механизм проникновения ДНК в цитоплазму еще не до конца понятен.

На первый взгляд, содержимое липосом попадает в цитоплазму в результате их слияния с плазматической мембраной клетки. Но, судя по имеющимся данным, все происходит иначе: вначале в цитоплазму проникают липосомы, и лишь потом из них высвобождается ДНК.

Внешне проникновение липосом в цитоплазму напоминает эндоцитоз: в местах сорбции катионных липосом плазматическая мембрана инвагинизируется (т. е. «впячивается»), образуя мембранные пузырьки. Мембранные пузырьки отпочковываются в цитоплазму и скапливаются вблизи клеточного ядра. Скопление большого количества эндоцитированного материала в околонуклеарном пространстве, по мнению исследователей, указывает на то, что эффективность трансфекции лимитируется на этапе высвобождения ДНК из эндосом.

Когда внутри эндосом находятся векторные конструкции, то, как правило, они (т. е. эндосомы) вначале трансформируются в лизосомы, с мембранами которых при низких рН и происходит слияние вирусных частиц. В случае липофекции попытки ингибировать функционирование лизосом за счет увеличения рН потерпели крах. Наоборот, при повышении рН с помощью хлористого аммония или хлорохина число генетически модифицированных клеток возрастало в несколько раз. Это навело на мысль, что при липофекции ДНК высвобождается в цитоплазму непосредственно из эндосом, минуя стадию образования лизосом. Более того, катионные липиды препятствуют попаданию ДНК в лизосомы.

Что касается самого механизма высвобождения ДНК, то он, по всей вероятности, базируется на обмене липидами между катионной липосомой и мембранами клетки, что ведет к нейтрализации катионного заряда и ослаблению связи ДНК с липосомой.

При слиянии комплекса ДНК-катионный липид с мембранным анионным липидом структура комплекса меняется, и в конце концов он распадается на отдельные компоненты, состоящие из молекул ДНК в окружении трубчатых бислойных липидных структур. Не исключено, что даже после высвобождения из липосом ДНК продолжает удерживать большое количество катионного липида. И это, в свою очередь, снижает эффективность трансфекции. Но все это только гипотезы. Для детального понимания причин низкой трансфекции нужны дополнительные исследования. Впрочем, как и для выяснения малоизученных механизмов переноса ДНК в клеточное ядро.

Потенциальная опасность

В «Конвенции о правах человека и биомедицине» Совета Европы отмечается: «Вмешательство в геном человека, направленное на его модификацию, может быть осуществлено только в профилактических, терапевтических или диагностических целях и только при условии, что подобное вмешательство не направлено на изменение генома потомков данного человека». Однако отношение к генотерапии постепенно меняется. До генетического вмешательства в половые клетки дело, правда, не дошло. Но в экспериментах на животных уже продемонстрирована возможность введения генов в эмбрион. Более того, председатель американского общества генной терапии, редактор журнала «Human Gene Therapy» Пол Андерсон предложил провести конкретные эксперименты на человеке по использованию подходов внутриматочной генной терапии, и в 1998 году Комитет по рекомбинантным молекулам, который занимается контролем всех генно-инженерных манипуляций в США, дал разрешение на проведение предварительных исследований на эмбрионах человека. В качестве объекта изучения были выбраны два тяжелейших наследственных недуга — комбинированный иммунодефицит, обусловленный дефектом гена аденозинаминазы, и гомозиготной β-талассемии, обусловленной либо отсутствием, либо мутациями всех четырех глобиновых генов. В случае удачи, несмотря на возможность негативных последствий для потомков, исследователи планируют перейти непосредственно к внутриматочной генотерапии.

Соматическая генокоррекция для последующих поколений вроде бы не опасна. Но, по мнению специалистов, и в этом случае риск попадания вводимых генетических конструкций в половые клетки, а значит, и вмешательства в генетический аппарат потомства все же существует.

Самому же пациенту неконтролируемое включение «терапевтических» генов в те или иные участки генома соматических клеток грозит нарушением функции «родных» генов, в том числе регулирующих процессы клеточного деления и иммунные реакции. А это, в свою очередь, может обернуться для больного нежелательными последствиями. В частности, развитием злокачественных опухолей.

И последнее. Работа с вирусными конструкциями должна вестись очень аккуратно. В противном случае конструкция может попасть не по назначению, а скажем, в организм врача.

Литература

  1. Зеленский А. В. Этика геномики // Человек.— 1999.— № 4-5.
  2. Маянский А. Н. Микробиология для врачей.— НГМА, Нижний Новгород, 1999.
  3. Полянская О. В. Генна терапія // http:/www.bioinfo.kiev.ua
  4. Келли К. С. Введение в генную терапию // http:/www.hemophilia.ru./medicine
  5. Генная терапия: предупреждение и надежда // Российский медицинский журнал.— 1997.— Т. 5, № 12.
  6. Баранов Л. Генная терапия // http:/www.pereplet/ru/obrazovanie/stsorase
  7. Жданов Р. И., Хусаинова Р. С., Иваницкий Г. Р., Борисенко А. С. Невирусные векторы в генной терапии. Новый подход в липофекции/ / Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии.— 2000.— № 1.




© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика