Логотип журнала "Провизор"








Тернистый путь

Л. В. Львова, канд. биол. наук

По оптимистическим прогнозам ученых, через каких-то пару десятилетий, когда наступит эра фармакогеномики, генотипирование станет рутинной процедурой, а лекарства будут обладать стопроцентной эффективностью при полном отсутствии побочных эффектов.

Радужные перспективы

Каких-то пятнадцать лет назад никто и слыхом не слыхивал о науке геномике. Тогда ее просто не было, и генетики занимались привычным делом — изучением наследственности и изменчивости живых систем. Кто на организменном уровне, кто на молекулярном. С запуском международного проекта «Геном человека» у исследователей наконец-то появилась возможность расшифровать структуру ядерного генома и выяснить механизм его функционирования. Так родилась геномика.

С первой задачей исполнители проекта справились — последовательность трех миллиардов пар нуклеотидов, образующих геном человека, определена. В ходе следующего этапа предстоит картографировать и проанализировать все гены человека. В том числе изучить все разновидности одного и того же гена, что, по мнению ученых, необходимо для выявления индивидуальной восприимчивости к той или иной болезни.

Сделать это чрезвычайно сложно. Хотя бы потому, что никто не знает, сколько генов надо искать — 60000 или 80000: точное число их неизвестно. Но даже знание численности генов, их структуры и хромосомной локализации — всего лишь полдела. Чтобы разобраться в процессах, происходящих в организме человека, исследователям необходимо понять, как функционируют гены, как действует система, регулирующая их работу. Самое трудное — выяснить все тонкости работы механизмов генной регуляции. С функциями генов дела обстоят получше: примерно для восьми тысяч генов они известны. Что касается остальных, то здесь надежду вселяют так называемые генетические маркеры или снипсы (от английского SNPs — Single Nucleotide Polymorphisms). Недавно общественный консорциум «Геном человека» в содружестве с крупнейшими фирмами, среди которых небезызвестные «Ай-би-эм» и «Моторола», даже запустил многосотмиллионный исследовательский проект с целью создания сводной карты этих самых снипсов. Проще говоря, точечных отличий в молекулах ДНК различных людей, вызванных заменой одного-единственного нуклеотида. Замен таких за время существования Homo sapiens, по имеющимся оценкам, накопилось немало: примерно одна мутация на каждую тысячу нуклеотидов (всего в геноме человека содержится три миллиарда пар нуклеотидов). Как выяснилось в ходе изучения снипсов, замена, происходящая поблизости от структурного гена, на участке ДНК, регулирующем его деятельность (или, по выражению генетиков, экспрессию), может сделать этот ген «восприимчивым» к тому или иному заболеванию — раку, гипертензии, диабету и т. д.— список можно продолжать до бесконечности. Причем подобная точечная мутация, как правило, передается по наследству вместе с «подопечным» геном. Именно неразрывная связь с близлежащими генами и делает эти замены генетическими маркерами, позволяющими довольно точно установить хромосомную локализацию генов «восприимчивости» и одновременно выявить предрасположенность к конкретной болезни. Дальше — дело техники. Выявил одну и ту же точечную замену в геномах разных людей. Затем собрал людей, страдающих тем или иным заболеванием, сравнил их геномы с геномами здоровых людей. Сразу же нашел, какой именно точечной заменой отличаются геномы здоровых и больных и какой ген находится вблизи обнаруженной мутации. Он-то, скорее всего, и будет геном, отвечающим за восприимчивость к данной болезни. Все вполне логично. Только вот объем работы гигантский. Тем не менее, в середине 90-х изучение подобных точечных замен в сочетании с исследованием генных аллелей стало рассматриваться не иначе, как путь к «индивидуализированной медицине», или, как ее теперь называют, фармакогеномике. Фармакогеномика, как надеются специалисты, позволит не только тестировать человека на склонность к той или иной болезни, но и при необходимости подбирать максимально подходящее к его генотипу лекарство, т. е. лекарство со стопроцентной эффективностью при полном отсутствии побочных эффектов. Конечно, это не значит, что фармацевтические фирмы будут создавать препарат для каждого отдельно взятого индивида. Нет. Просто лекарства будут разрабатываться для групп людей с одинаковыми «генетическими портретами». По крайней мере, касательно чувствительности к разрабатываемому лекарственному средству.

По оптимистическим прогнозам доктора Коллинза, руководителя проекта «Геном человека», появление индивидуализированных лекарств не за горами — в 2020 году все лекарственные средства будут разрабатываться с использованием фармакогеномики. Может, так и будет. Но вряд ли. Конечно, работа по выявлению снипсов продвигается довольно быстро: за год участникам проекта удалось обнаружить более ста тысяч точечных замен. Но есть одна загвоздка. Если в самом начале организаторы проекта считали, что для составления сводной карты, позволяющей проводить сравнительный анализ, им будет достаточно найти сто пятьдесят тысяч снипсов, то год спустя стало ясно, что этим не обойтись: численность искомых точечных замен возросла, как минимум, до пятисот тысяч. С целью составления каталога пятисот тысяч снипсов и установления связи каждого обнаруженного снипса с той или иной болезнью был создан еще один, британский консорциум, в который вошли десять ведущих фармкомпаний и благотворительный Английский фонд для поддержки исследований Wellcome Trust. Как заявили организаторы консорциума, все данные, полученные в ходе исследований, станут достоянием общественности и любая организация сможет воспользоваться ими при разработке лекарств.

Но даже если будут найдены все снипсы и установлены их связи с заболеваниями, остается еще одна, не менее важная проблема — выявление и анализ регуляторных участков ДНК, поскольку не только точечные замены, но и другие изменения в этих участках могут стать причиной индивидуальных различий людей. Даже тех, у кого аллели структурных генов не отличаются.

Пример подобных изменений — метилирование, т. е. присоединение к некоторым звеньям регуляторного участка группы СН3, которое сказывается на индивидуальных особенностях людей, в том числе на восприимчивости к тем или иным болезням. Метилирование вместе с другими способами влияния на регуляторные участки и, как следствие, на активность структурного гена стало предметом изучения еще одной юной науки — эпигенетики («эпи» в переводе с греческого — рядом, около). В декабре 1999 года несколько ведущих европейских центров решили создать Европейский эпигенетический консорциум с целью идентификации и анализа различных вариаций четырехсот тысяч участков генома, подвергающихся метилированию.

Но пока одни ученые занимаются поиском снипсов и эпигенетическими изысканиями, другие с не меньшим энтузиазмом занимаются выявлением и расшифровкой информационных РНК, которые в изобилии производятся работающим геномом и предназначены для передачи информации о продуцируемом белке от гена к рибосомам — «фабрикам» по его производству. Сторонники такого подхода (их обычно называют транскриптомистами) глубоко убеждены, что это оптимальный путь изучения работы генов. Тем более, что выловить и опознать молекулу РНК не составляет особого труда.

Для этого просто нужно взять биочипс — небольшую пластинку, на которую подвешены короткие отрезки ДНК, извлеченные из расшифрованных генов, — опустить его в протоплазму, извлеченную из какой-либо клетки, и к каждому такому отрезку «прилипнет» соответствующая РНК. После чего исследователю остается извлечь биочипс из раствора и проанализировать состав налипших на пластинку РНК. Благо, сегодня вся эта процедура автоматизирована.

Надо заметить, что приверженцев протеомики не устраивает ни один из описанных подходов. На взгляд протеомистов, наиболее короткий путь к изучению генов — исследование их белковых продуктов. В первую очередь, белков, важных для понимания механизмов заболевания и его диагностики.

Делается это следующим образом. В начале проводится двумерный электрофорез нормальной и патологически измененной ткани, позволяющий выявить до десяти тысяч различных белков. Проанализировав электрофореграмму, исследователь выясняет, насколько изменился белковый состав патологически измененной ткани, количество каких именно белков увеличилось или уменьшилось в ней. Именно эти белки — возможные диагностические маркеры и потенциальные молекулярные мишени для новых лекарств — и подвергаются дальнейшему изучению: на масс-спектрометре определяется их молекулярная масса, а на секвенаторе — первичная структура (т. е. аминокислотная последовательность). Таким способом за неделю можно идентифицировать до сотни различных белков.

При кажущейся простоте, и здесь не все так гладко, как хотелось бы.

Во-первых, разделить гидрофобные (т. е. водоотталкивающие) белки с помощью электрофореза весьма проблематично. А ведь гидрофобность присуща всем белкам-рецепторам, которые по идее являются самыми важными мишенями для лекарств. Во-вторых, молекулярная масса и первичная структура не дает полного представления о работе белка: функционирование белка во многом определяется его пространственной структурой. Или, проще говоря, формой, которая, как известно, легко меняется с изменением окружающей среды. К примеру, под воздействием того же рН.

Тем не менее, работа над составлением каталога белков важнейших органов человека продолжается. Самое большое достижение протеомики — получение протеомного индекса женщины-донора, включающего информацию о 150 различных биоптатах и 115 тысячах белков, продуцируемых двенадцатью тысячами генов.

Грубая реальность

По расчетам западных специалистов, нормальное развитие фармацевтических предприятий предполагает ежегодное 10% увеличение объемов производства за счет разработки новых активных соединений. В последние годы в крупных фармацевтических фирмах таких веществ разрабатывается меньше, чем необходимо для сохранения оптимальных темпов роста производства. При этом расходы на исследование и разработку лекарственных препаратов неуклонно растут. В основном, по причине недостаточной эффективности и безопасности исследуемых веществ.

Выход из сложившейся ситуации фармацевтические фирмы видят один: коренное изменение методов поиска и разработки новых лекарственных средств с использованием фармакогеномики.

Согласно прогнозам американской консалтинговой компании «Front Line Strategic Management Consulting» на 2010 год, использование геномных технологий для разработки лекарственных средств с учетом генетических факторов, обусловливающих индивидуальную реакцию организма в ответ на медикаментозное воздействие поможет фармацевтическим компаниям сократить расходы на исследования и разработку одного лекарственного препарата в среднем на 33 млн долл. В частности, благодаря использованию метода генотипирования с учетом точечных замен (так называемого SNP-генотипирования), сократится число участников клинических испытаний и продолжительность клинического этапа разработки новых препаратов. Ожидается, что рынок технологий, позволяющих проводить SNP-генотипирование, будет экспоненциально увеличиваться и к 2005 году достигнет 1 млрд долл. в стоимостном выражении. При этом, если верить расчетам экспертов, применение фармакогеномики в исследовании и разработке одного лекарственного препарата может принести фармкомпании более 3 млрд долл. дополнительного дохода в течение «жизненного цикла» препарата на фармацевтическом рынке. Кроме того, те же расчеты показывают, что за счет использования SNP-тестов для предварительного скрининга пациентов в отношении реакции организма на определенное лекарственное средство к 2010 году в США на треть повысится эффективность медикаментозного лечения и на четверть сократится число побочных реакций. И в результате расходы на лечение больных сократятся приблизительно на миллиард долларов. Но это в перспективе. Хотя и сейчас компании, специализирующиеся на фармакогеномике, могут предложить целый комплекс услуг. К примеру, один из пионеров фармакогеномики — французская компания «Genset» предлагает фармацевтическим фирмам:

  • проводить идентификацию снипсов и генов, ассоциированных с эффективностью и безопасностью лекарственного препарата (как на стадии разработки, так и на стадии клинического применения);
  • предоставлять этим фирмам исключительные права на патенты, полученные в ходе исследований;
  • участвовать в разработке лекарств нового поколения путем изучения потенциальных мишеней для фармакологического воздействия и исследования полиморфизма генов, отвечающих за индивидуальную реакцию человека на тот или иной препарат.

Кроме того, «Genset» специализируется на разработке скрининговых фармакогеномных тестов для выявления пациентов с высоким риском развития побочных эффектов. Пример тому — контракт «Genset» с американской компанией «Abbot Laboratories» о совместной разработке диагностического теста для генетического скрининга больных астмой, которым противопоказано назначение препарата ZyfloR по причине его токсического воздействия на печень, и соглашение с компанией «Pharmacia&Upjohn» о предоставлении ей фармакогеномных технологий для идентификации снипсов и генов, участвующих в формировании реакции организма на воздействие одного из лекарственных средств, разработанных «Pharmacia&Upjohn».

Фармакогеномика и рак

Не секрет, что восприимчивость к химиотерапии — вещь сугубо индивидуальная. По статистике, после курса химиотерапии ремиссии у ранее нелеченных онкологических больных наблюдаются в 30%, максимум — в 50% случаев. Остальным пациентам, кроме весьма неприятных побочных эффектов, прием высокотоксических препаратов ничего не дает. Причина наблюдаемого феномена проста: не располагая сведениями о механизмах чувствительности к тому или иному лекарственному средству, врач, назначая курс химиотерапии, исходит в основном из клинических данных.

Но благодаря фармакогеномике ситуация постепенно меняется.

Взять хотя бы методику, разработанную Майклом Кронбергом, профессором Королевского Университета в Кингстоне. Основанная на изучении генного профиля пациента с учетом данных известного исследователя-онколога Тода Голуба, она позволяет моделировать реакцию больных острой лейкемией на тот или иной вид химиотерапии с точностью до 80%.

Достаточно перспективным кажется и изучение причин резистентности к циспластину и препаратам из группы таксанов, базирующееся на исследовании онкогенов и опухолевых супрессоров.

К онкогенам принято относить клеточные и вирусные (т. е. вносимые в клетку вирусом) гены, экспрессия которых может привести к развитию злокачественного новообразования. Сегодня число таких генов приближается к сотне. К опухолевывым супрессорам относятся около двух десятков клеточных генов, инактивация которых резко увеличивает риск возникновения рака, а восстановление функции, напротив, способно подавить рост новообразования. К инактивации гена-супрессора могут привести и мутации, и эпигенетические изменения.

В частности, при раке легкого ключевые опухолевые супрессоры — MGMT и MLH1 могут «утратить работоспособность» (и тем самым ухудшить прогноз заболевания) в случае метилирования определенных участков. Кстати говоря, экспериментально доказано участие этих же генов в формировании резистентности к циспластину. Клинических доказательств пока нет: получение серийных биопсий у одного и того же больного — задача трудно разрешимая. Получать же необходимые данные, выделяя опухолевую ДНК из сыворотки больного, научились совсем недавно. Однако применение этой методики в клинической практике в корне изменило представление об онкологических заболеваниях: как оказалось, нередко даже на начальных стадиях рак является диссеминированным заболеванием. Началось все с обнаружения изменений в микросателлитах сывороточной ДНК у больных с мелкоклеточным раком легкого. Дальше — больше. Аналогичные микрометастазы в кровотоке были выявлены у многих больных с карциномой почки, немелкоклеточным раком легкого, с карциномой головы и шеи. Причем при немелкоклеточном раке легкого размер опухоли не превышал двух сантиметров в диаметре.

Кроме того, после резекции легкого у пациентов с немелкоклеточной формой рака было обнаружено гиперметилирование четырех опухолевых супрессоров, аномалии ДНК сыворотки.

Характерно, что после курса лечения аномалии в сывороточной ДНК исчезают не всегда. Пример тому — результаты геномного обследования пятнадцати больных раком поджелудочной железы. До лечения мутации гена K-ras были выявлены у девяти из них. У шести больных после курса химиотерапии они исчезли. (Для справки. В нормальном состоянии ген K-ras отвечает за продуцирование белка, участвующего в передаче митогенных сигналов и регуляции морфогенетических реакций. С появлением мутаций образуется иная форма того же белка, что влечет за собой нарушения митоза и морфогенеза.) Объяснение этого феномена требует дальнейших исследований.

Один из генов, привлекших внимание исследователей, при изучении механизма действия препаратов группы таксанов — мутантный аллель гена р53.

В жизни клетки белковый продукт нормального аллеля этого гена играет чрезвычайно важную роль: так называемый дикий тип гена р53 контролирует целостность генома, участвует в транскрипции генов, регулирует клеточный цикл и апоптоз — генетически запрограммированную гибель клеток.

Работает ген р53 следующим образом. На возникновение повреждений ДНК под влиянием каких- либо генотоксических факторов он отвечает увеличением своей активности. В итоге содержание белка с молекулярной 53 кДА в ядре увеличивается. Это, в свою очередь, приводит к подавлению целого ряда генов, регулирующих транскрипцию и причастных к задержке клеток в начальных фазах клеточного цикла. Благодаря такому блокированию, повреждения в ДНК устраняются, и появление мутантных клеток предотвращается. Если же по каким-то причинам репарационные системы не в состоянии устранить повреждения в ДНК, тогда продукт гена р53, действуя через белок Вах, запускает программу уничтожения мутантных клеток и тем самым устраняет опасность злокачественной трансформации.

Мутантному гену р53 все это не под силу. Наоборот, его присутствие помогает клеткам с поврежденным геномом сохранять жизнеспособность в процессе деления, что теоретически чревато выживанием клеток, подвергшихся злокачественной трансформации. И, действительно, различные мутации гена р53 у онкобольных обнаруживаются довольно часто, хотя и не всегда. Тем, у кого в злокачественных опухолях присутствует дикий тип гена р53, можно считать повезло: такие опухоли легко поддаются лечению. В отличие от опухолевых клеток с мутантными аллелями: на них традиционная химиотерапия не оказывает должного эффекта. Кроме того, как выяснилось, от гена р53 во многом зависит чувствительность опухолевых клеток к таксолу — препарату из группы таксанов, терапевтическое действие которого обусловлено воздействием на основу клеточного цитоскелета — тубулиновые микротрубочки. Состоят тубулиновые трубочки из глобулярных белков двух типов, известных как α- и β-тубулины. Вернее, из нескольких линейных полимеров, образованных чередующимися α- и β-тубулинами, и расположенных по кругу. Действует ген р53 не сам по себе, а опосредовано, через ген МАР4, ответственный за синтез белка, связывающегося с микротрубочками. В тех случаях, когда под влиянием гена р53 продуцирование белкового продукта гена МАР4 увеличивается, степень полимеризации микротрубочек возрастает и, как следствие, облегчается связывание таксола, чувствительность клеток к препарату увеличивается. Эти сведения натолкнули исследователей Калифорнийского Университета в Дэвисе на проведение испытаний по последовательной химиотерапии немелкоклеточного рака легкого.

Нельзя не заметить, что поиск потенциальных генов-мишеней для прицельной фармакотерапии не ограничивается изучением мутаций гена р53. Не менее обнадеживающими представляются и исследования гена, ответственного за синтез β-глобулина. Свидетельство тому — результаты секвенирования (т. е. определения нуклеотидной последовательности) этого гена, выделенного из сывороточной ДНК 49 больных немелкоклеточным раком легкого, получавших лечение таксолом в форме монотерапии. У 16 из них были обнаружены мутации в гене β-тубулина. У всех этих больных отсутствовала реакция на таксол, а время выживания было существенно меньшим, чем у больных, не имевших мутаций. В ходе дальнейших исследований стало ясно, что важную роль в формировании резистентности к таксолу играют мутации, влияющие на положения Leu 215, Leu 217 и Leu 228.

Дело в том, что, с одной стороны, сборка микротрубочек во многом зависит от лейцинового кластера: аминокислотные остатки в положении 215 и 217 приходятся на петлю, соединяющую спирали Н6 и Н7, а остаток лейцина в положении 228 находится в составе спирали Н7. С другой стороны, именно эта область участвует в связывании с таксолом. Вроде бы все логично. Но чтобы доказать влияние экспрессии изотипов гена β-тубулина на проявление лекарственной устойчивости, нужны массовые обследования больных. Они сейчас проводятся. Одновременно намечается путь к преодолению резистентности к таксолу в клетках немелкоклеточного рака легкого с гиперэкспрессией β-тубулина: как показал эксперимент, применение антисенс-олигонуклеотидов к β-тубулину значительно снижает экспрессию соответствующей (т. е. β-тубулиновой) матричной РНК в резистентных к таксолу клетках рака легкого А549-Т24.

Надо сказать, что действие таксола на клетку стабилизацией тубулиновых полимеров в период образования митотического веретена не ограничивается. Например, цитотоксичность таксола связана с фосфорилированием ингибитора апоптоза Bcl-2 и киназы Raf-1, участвующей в процессе фосфорилирования/дефосфорилирования белков-индукторов апоптоза. В клетках с избыточным содержанием Bax — белка-индуктора апоптоза — нарушается его откачка из клетки.

Этим число потенциальных генов-мишеней для фармакогенной химиотерапии не исчерпывается. Есть еще и другие. И не только в ядерном геноме, но и в митохондриальном. Но о механизме формирования митохондриальной резистентности на сегодняшний день мало что известно.

И все-таки вполне возможно, что в ближайшем будущем индивидуализация химиотерапии больных, дающих рецидив заболевания, действительно произойдет. Предпосылкой к столь оптимистичному прогнозу является запланированное испанской и швейцарской группами по раку масштабное рандомизированное исследование эффективности двух схем лечения начальных стадий немелкоклеточного рака легкого. (Первая схема включает назначение неоадъювантной химиотерапии: таксол 200 мг/м2 + карбоплатин по критерию площади под кривой концентрация—время [AUC] и последующее хирургическое вмешательство. Вторая — проведение хирургической операции с последующими тремя курсами той же химиотерпии.) И самое главное. В ходе исследования предполагается

  • провести скрининг на мутации генов тубулина;
  • выявить корреляцию между генами тубулина и K-ras с рецидивами и выживанием;
  • провести испытание информативности редких аллелей H-RAS1 VNTR;
  • выявить остаточное заболевание;
  • установить корреляцию между генетическими дефектами с одной стороны и рецидивированием и выживаемостью с другой;
  • исследовать гиперметилирование ряда генов, в том числе генов MGMT, MLH1 и гена ингибитора ангиогенеза — тромбоспондина-1;
  • выяснить, будет ли мутация K-ras, присутствующая до начала лечения, исчезать после проведения химиотерапии.

Литература

  1. Фармакогеномика поможет компаниям сократить расходы на исследования и разработки // Фармацевтический вестник.— 2001.— № 12 (283)
  2. Россел Р., О'Брэйт А., Монзо М. и др. Фармакогеномика и современные тенденции в лечении немелкоклеточного рака легкого // http://www.rosoncoweb.ru.
  3. Механизмы действия онкогенов и опухолевых супрессоров // http://www.ournet.md
  4. Нудельман Р. Геном и что дальше? // Наука.— 2001.— № 26
  5. Арчаков А. Геномика, протеомика, биоинформатика//http://www.pereplet.ru




© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика