Логотип журнала "Провизор"








В начале пути:
заметки с международного семинара «Лабораторные животные — возможности альтернативы в экспериментальной фармакологии»

Л. В. Львова, канд. биол. наук

Наступит время, когда мир будет смотреть на современную вивисекцию во имя науки, как он смотрит сейчас на сжигание людей на кострах во имя религии.
Х. Байджлоу, профессор медицины

До безоблачного будущего доктора Байджлоу далеко. Но мы все-таки приближаемся к нему, хотя, возможно, и не так быстро, как хотелось бы. В этом можно было убедиться, побывав на семинаре, проведенном по инициативе ГЦНЛС и Харьковской ассоциации биоэтики.

Предыстория

Животные — суть бездушные машины, и все движения их организма чисто механические, утверждал Декарт. Ученые поверили ему. Вивисекция стала неотъемлемой частью науки. Ни о каком облегчении страданий своих подопытных исследователи даже не помышляли — анестетиков тогда не было. Да, если бы и были, зачем обезболивание «бездушным машинам»? Только со временем, XVII и XVIII века стали считать самыми жестокими в истории науки.

Первое Общество по предотвращению жестокости к животным было создано в Великобритании, в 1824 году. Здесь же, в Великобритании, двумя годами раньше Ричарду Мартину удалось провести через парламент «Акт по предотвращению жестокого и недостойного обращения со скотом». Но запрещения вивисекции Мартин так и не смог добиться ни тогда, ни в последующие годы.

Несколько позже в Великобритании зародилось движение против вивисекции, а потом появилось и Национальное общество антививисекционистов, которое столетие спустя превратилось в Международную ассоциацию против болезненных экспериментов на животных. В 1876 году после длительной борьбы между сторонниками вивисекции и защитниками животных Британский Парламент наконец-то утвердил Акт в защиту экспериментальных животных, предписывающий использование обезболивающих средств во время опытов.

В соседней Франции, где вивисекцией занимались с особым размахом, Анна Кингсфорд, англичанка по происхождению, умудрилась получить диплом врача, не проведя ни одного опыта на животных. Ее поступок настолько поразил французов, что они решили создать Общество противников вивисекции. На пост президента пригласили Виктора Гюго. Приглашение писатель принял, поскольку считал вивисекцию преступлением, от которого человеческая раса должна отречься.

Во второй половине XIX века подобные Общества были основаны во многих европейских странах и в США.

Создатель Американского общества по предотвращению жестокости к животным Генри Берг долгие годы пытался провести закон о запрещении вивисекции. Его попытки не увенчались успехом. Но борьба продолжалась. В нее включились даже медицинские светила того времени. Но их главным образом волновали души будущих врачей. «Последите за студентами во время вивисекции. Все их внимание отдано не науке, а крови и страданиям, на которые они смотрят, затаив дыхание. Если работа в больнице делает молодых студентов менее восприимчивыми к страданиям, то вивисекция убивает их гуманность и порождает безразличие к ней»,— писал профессор медицины Харвадского университета Х. Байджлоу.

Именно по этой причине, но уже в наше время в Швеции, Англии и Италии ветеринары, биологи и медики получают альтернативное образование. Вместо подопытных животных на практических занятиях студенты используют компьютерные программы, математические модели и видеофильмы, лечат больных животных и оперируют трупы умерших естественной смертью.

В Советском Союзе движение в защиту животных возникло позднее, чем в других странах. Вначале была создана секция охраны животных при Московском отделении Всероссийского общества охраны природы. Потом аналогичные секции появились в Ленинграде, Киеве, Ялте и Одессе. Все организации работали «на голом энтузиазме» без какой-либо финансовой поддержки государства. Тем не менее сделали они немало. Благодаря деятельности секций были подготовлены и направлены в Министерство здравоохранения многочисленные документы, свидетельствующие о жестоком обращении с лабораторными животными, о плохих условиях содержания «опытного материала» и его использовании в болезненных экспериментах без наркоза. Результат не заставил себя ждать. В 1977 году министр здравоохранения СССР, академик Б. В. Петровский утвердил «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Тюрьма со всеми удобствами

В отличие от Декарта доктор Роберт Хубрехт, представитель UWAF (т. е. Федерации университетов по охране животных), считает, что животные тоже чувствуют (Dr. Hubrecht Good Welfare and Good Science — A Partnership). И коль нельзя полностью отказаться от экспериментов на них, то нужно хотя бы заботиться о подопытных. Только вот понять их без помощи науки невозможно. Потому-то UWAF, сама будучи благотворительной организацией, и спонсирует исследования, ориентированные на улучшение содержания лабораторных животных. Да к тому же организовывает конференции и семинары, сотрудничает с ведущими фармацевтическими фирмами и выпускает два популярнейших в ученом мире издания: справочник (Lab Animal Handbook) и журнал (Journal Animal Welfare). И еще сотрудники Федерации Рассел и Берч несколько десятков лет назад разработали концепцию 3R, ставшую впоследствии «руководством к действию» в опытах на животных.

Суть концепции состоит в следующем.

Во-первых, до начала исследования экспериментатор должен проверить, можно ли провести опыты без участия животных. Во-вторых, если такая возможность отсутствует, он обязан свести число подопытных животных к минимуму (но так, чтобы эксперимент от этого не пострадал). В-третьих, экспериментатор должен минимизировать страдания животных. (По Расселу и Берчу животные испытывают две категории страданий: страдания непосредственные, связанные с самой процедурой исследования, и страдания косвенные, обусловленные непреднамеренным воздействием на состояние подопытных. Именно страдание второго типа и должен свести к минимуму исследователь.)

Справедливости ради нельзя не заметить, что с первыми двумя R проблем практически не возникает. Другое дело — третье R. Здесь ситуация намного хуже из-за финансовых или организационных проблем.

О том, что плохие условия содержания могут усугублять муки животных, Рассел и Берч говорили еще в 50-е годы, когда при проектировании стандартизированных вольеров в расчет принимались только соображения удобства обслуживающего персонала и исследователей. Стандартизации как таковой они не отрицали. Наоборот, придавали ей огромное значение, поскольку стандартизация позволяет снизить статистический разброс результатов, а значит, и уменьшить число подопытных животных.

К сожалению, в то время чрезвычайную распространенность получили голые клетки, которым впоследствии было суждено превратиться в стандарт. Такая стандартизация, в свою очередь, затруднила введение каких-либо новшеств.

Тем не менее улучшать условия содержания необходимо. И не только из этических соображений. Без этого не может быть «высококачественной» науки с ее высокими требованиями к результатам опытов. Без этого, наконец, невозможно, усовершенствование законодательства в отношении «опытного материала».

Что касается этических проблем, то существуют неопровержимые доказательства повышенной активности животных, обитающих в клетках с удобствами, по сравнению с их собратьями, живущими в пустых клетках. И сегодня этологи, наряду c учетом «предметов первой необходимости» — пищи и воды, уже научились индивидуально определять потребность животных в дополнительных удобствах — будь то гнездовья для грызунов или игрушки для собак. К тому же животные, являясь продуктом эволюции, приспособлены к обитанию в естественной для себя среде. Естественно, они обладают способностью адаптироваться к новым условиям. Но адаптационные возможности не безграничны. Нередко адаптация дает сбой и, как результат,— расстройство «телесного» здоровья либо аномальное (или стереотипичное) поведение. У собак, к примеру, частота проявления аномального поведения напрямую зависит от длительности пребывания в плохо оборудованном вольере. У кроликов стереотипы поведения могут возникнуть даже из-за изменения привычного времени кормления.

Очень плохо животные реагируют на транспортировку и шум. (У человека шум, как известно, вызывает изменение темпов метаболизма, нарушение иммунного статуса и приводит к развитию гипертензии. Не исключено, что аналогичное действие он оказывает и на животных.)

Вполне понятно, что любой из этих стрессовых факторов — будь то плохие жизненные условия, транспортировка или шум — ни в коей мере не способствует уменьшению статистического разброса результатов эксперимента.

Это еще раз подтвердили исследования Деймона, который установил, что перевод крыс из привычной клетки в незнакомую, метаболическую, сопровождается снижением токсической дозы урановой руды до 3–8 мг/кг. (У животных, тестированных в обычных клетках или успевших привыкнуть к метаболическим клеткам, токсическая доза была в сотни раз выше и достигала 220–650 мг/кг.)

Существуют и доказательства благоприятного влияния на животных общения с собратьями и «смены впечатлений». В частности, у крыс, поселенных в многоместных клетках и каждый день получающих новые «развивающие» игрушки, значительно возрастала поверхность астроцитов, а объем капилляров достигал 80% на нерв. У щенков, живших в вольерах с удобствами, гораздо лучше развивался головной мозг и намного реже наблюдались случаи аномального поведения.

При всей полезности подобных исследований финансируются они не так хорошо, как хотелось бы. Тем не менее UWAF продолжает изучение познавательной способности и мотивации поведения лабораторных животных, разрабатывает новые методы оценки их «благополучия». Вдобавок ко всему Федерация тесно (и довольно успешно) сотрудничает с ведущими фармацевтическими фирмами Великобритании по вопросам улучшения условий содержания животных.

Что касается законодательства по защите животных, то здесь базовым документом является Конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, принятая Европейским Союзом в 1986 году, и Директива 86/609 ЕЭС, основанная на тексте этого соглашения (Dr. Robert Hubrecht, Current EU Legislation Controlling Animal Experiments).

Оба документа базируются на том, что животным необходимо обеспечить надледжащий уход и условия содержания. А «любое ограничение степени удовлетворения физиологических и этологических потребностей животных должно сводиться к минимуму». В 1997 году был начат пересмотр основных принципов содержания и ухода за животными с учетом новых данных об их физиологических, социальных и поведенческих потребностях. Завершить пересмотр планировалось еще в прошлом году, но процесс оказался настолько трудоемким, что вряд ли его удастся закончить даже в 2003 году.

Альтернатива

На Западе вместо доклинических испытаний на животных нередко используются исследования на клеточных и органных культурах. У нас этот процесс только начинается.

В реальных условиях фармацевтического производства и поныне существует опасность пирогенных загрязнений лекарственных средств.

Пирогенность препаратов, большей частью, имеет микробное происхождение и вызывается грамотрицательными бактериями. Точнее, их эндотоксинами — липополисахаридными осколками клеточных стенок. Эндотоксины, очень устойчивые к обычным способам стерилизации, при парентеральном введении могут спровоцировать у пациента развитие лихорадки, токсического шока, тромбоцитопении, резких метаболических нарушений и анафилактического шока. По этой причине в 1940 году был разработан фармакопейный метод определения пирогенов с использованием подопытных кроликов.

Сорок лет спустя, в 1980 году, в США появилась альтернатива тесту на кроликах — LAL-тест. В 1984 году ссылку на этот тест содержали пять описанных в USP водных препарата, а 23-м издании USP — уже 680 препаратов.

Появлению LAL-теста предшествовала многолетняя работа.

Обнаружив, что введение бактерий (или осколков их клеточных стенок) в кровяное русло краба-мечехвоста вызывает его гибель, американские исследователи Фрэнк Бэнг и Джек Левин со временем выяснили, что эта смерть связана с защитным механизмом реликтового краба. Дело в том, что крабы-мечехвосты уже в течение миллионов лет обитают в придонной части моря с очень высоким содержанием бактерий. Естественно, что в таких условиях любое повреждение покровов краба может повлечь за собой вторжение патогенных микроорганизмов. На этот случай природа наделила амебоциты — единственный тип «кровяных» клеток краба — уникальной способностью: при контакте с бактериями они запускают механизм свертывания гемолимфы. Образовавшийся сгусток закупоривает место повреждения, тем самым предотвращая дальнейшую потерю гемолимфы и защищая животное от заражения.

Позднее это уникальное свойство гемолимфы краба-мечехвоста было использовано при разработке коммерческого реактива для определения пирогенности. По имени реактива, образованного первыми буквами словосочетания «Limulus Amebocite Lisate» получил название и тест на пирогенность.

Получение LAL-реактива — процедура для крабов вполне безопасная: у них берут всего лишь треть (т. е. примерно 200 мл) крови и отпускают в море. Но замена традиционного теста на кроликах на LAL-тест объясняется не только «гуманностью тестирования», но и низкой чувствительностью кролика к пирогенам: если у человека повышение температуры возникает при внутривенном введении 0,3 ЭЕ/кг (по другим данным — 4–8 ЭЕ/кг), то у кролика эта величина составляет 10–15 ЭЕ/кг. Кроме того, определенные группы инъекционных препаратов и технологического оборудования на кроликах испытывать просто невозможно или, по меньшей мере, некорректно. Это:

  • ненаркотические анальгетики, транквилизаторы, нейролептики, кортикостероиды и некоторые анестетики (т. е. препараты-антипиретики, вызывающие понижение температуры тела, и, следовательно, способные маскировать наличие пирогенов);
  • препараты плаценты, вакцины, новокаин (т. е. препараты, вызывающие повышение температуры, обусловленное их фармакологическими свойствами);
  • средства для наркоза, сердечные гликозиды, наркотические анальгетики, инсулин, адреналин, снотворные средства, деполяризующие миорелаксанты (т. е. препараты, которые в силу своих фармакологических свойств вызывают изменения физиологического состояния животных);
  • инфузионные препараты, суточный объем введения которых превышает 700 мл;
  • радиофармацевтические препараты;
  • лекарственное сырье, ампулы, флаконы и все элементы технологического оборудования.

Особенно желательно применение LAL-теста при проверке препаратов антигенной природы и препаратов крови, поскольку их введение ограничивает дальнейшее использование кроликов. В равной степени это относится и к антибиотикам: большие дозы антибиотиков, воздействуя на микрофлору, вызывают у кроликов дисбактериоз или, как в случае линкомицина гидрохлорида — кандидомикоз.

В Государственной Фармакопее Украины в общей статье «Бактериальные эндотоксины» приведено пять (из более чем тридцати используемых на Западе) возможных метода проведения LAL-теста:

  • метод гелеобразования: предельное испытание, которое согласно ГФУ считается базовым. Гель–тромб–тест не требует особых навыков выполнения и дорогостоящего оборудования, но по чувствительности уступает турбидиметрическому и хромогенному методам;
  • полуколичественный метод гелеобразования;
  • турбидиметрический кинетический метод;
  • кинетический метод с использованием хромогенного пептида;
  • метод конечной точки с использованием хромогенного пептида.

За рубежом LAL-тест широко используется уже много лет. Более того, Томас Хартунг разработал новый, иммунохимический тест на пирогены. У нас же делаются лишь первые шаги по внедрению LAL-теста. Из множества отечественных фармацевтических фирм на него перешли только несколько: ОАО «Фармацевтическая компания «Здоровье», ХГФП «Здоровье народу», «Индар», ЗАО НПЦ «Борщаговский химико-фармацевтический завод», ФФ «Дарница» и АО «Галычфарм» (Чайка Л. А., Гомон О. Н., Меркулова Ю. В. LAL-тест — надежная замена контроля пирогенности на животных).

За рубежом альтернативные технологии все чаще и чаще используются при создании лекарств. И это естественно: с помощью комбинаторной химии, виртуального скрининга или компьютерного моделирования исследователю гораздо легче отобрать необходимое действующее вещество.

Краткая справка. Комбинаторная химия использует специальные технологии для синтеза мизерных количеств соединений из «структурных блоков». А комбинаторные библиотеки соединений, насчитывающие тысячи индивидуальных веществ или смеси изомеров, размещены в планшетах, что существенно упрощает дальнейший тотальный скрининг.

Виртуальный скрининг предполагает прогнозирование физических, физико-химических и фармакологических свойств ожидаемой субстанции при помощи компьютерного анализа количественной и качественной взаимосвязи между структурой «виртуального» соединения и его биологической активностью. Компьютерное моделирование имеет иную задачу: по заданной фармакологической активности этим методом определяется структура соединения-лидера.

Для украинских специалистов многие современные технологии недоступны из-за дороговизны. Отечественные химики и фармакологи используют, в основном, традиционные методы синтеза и скрининга предполагаемых биоактивных соединений. А жаль.

В Институте проблем эндокринной патологии на собственном опыте смогли убедиться в перспективности использования компьютерного анализа (Комарова И. В., Яременко Ф. Г. ,  Божко Т. С., Ладогубец Е. В.  Альтернативные методы в фармакологии).

Воспользовавшись программой прогноза спектра биологической активности, разработанной российским профессором В. В. Поройковым, основанной на идее о том, что избирательность того или иного биологического действия относительна и большинство соединений одновременно обладает многими видами биологической активности, они проанализировали более сотни соединений. Для некоторых из них помимо подтверждения ожидаемой биологической активности программа выявила дополнительные фармакологические и биологические эффекты, что в определенной степени помогло разобраться в механизмах действия новых соединений.

В этом же институте было продемонстрировано преимущество оценки специфической активности потенциальных антитиреоидных и тиреостатических препаратов в сравнении с традиционными скрининговыми исследованиями in vivo: использование органной ткани позволяет избежать погрешностей, связанных с изменением нормального баланса в системе гипофиз—щитовидная железа под действием биологически активных соединений.

Доклиническое изучение иммунотропных свойств лекарств in vivo, по мнению Л. В. Гладковой, следует заменить исследованиями на генетически однородных культурах клеток, растущих в постоянных условиях (Л. В. Гладкова, ГЦНЛС «Изучение иммуномодулирующего влияния лекарственных препаратов в опытах in vitro). Во-первых, это гарантирует высокую стандартность объектов эксперимента. Во-вторых, позволит оценивать жизнеспособность клеток на протяжении всего опыта. В-третьих, это экономически выгодно: вместо дорогостоящих линейных животных требуется сравнительно небольшое количество биологического материала, что позволяет одновременно проводить не только испытание нескольких препаратов в различных дозах, но и различных схем их применения. Причем использование клеточных культур человека при доклинических исследованиях создает уникальную возможность уменьшить вероятные ошибки и отрицательные результаты при клинических испытаниях, поскольку и в физиологическом, и в патогенетическом аспектах иммунобиологические параметры человека и животных несколько отличаются.

Прежде чем отнести тот или иной препарат к категории иммунотропных средств, нужно оценить его способность усиливать неспецифическую резистентность организма и изучить его влияние на клеточный и гуморальный иммунитет. Кроме того, желательно сопоставить митогенный, митостатический и лимфостатический эффекты препарата.

С этой целью в лаборатории и аллергологии ГЦНЛС с использованием культуры клеток проводится:

  • оценка влияния препарата на неспецифическую резистентность;
  • оценка влияния препарата на пролиферативную активность Т-и В-лимфоцитов;
  • оценка влияния препарата на синтез цитокинов;
  • оценка влияния препарата на функциональную активность естественных киллеров;
  • определение функциональных свойств иммунорегуляторных клеток в тестах конканвалин А индуцированной супрессорной активности;
  • оценка влияния препарата на субпопуляции регуляторных Т-лимфоцитов (т. е. Т-хелперов и Т-супрессоров);
  • оценка пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов в реакции бласттрансформации на митоген;
  • оценка митогенных свойств препарата.

Для оценки качества лекарственных препаратов харьковские ученые предлагают использовать метод КВЧ-диэлектрометрии в миллиметровом диапазоне длин волн: их исследования убедительно доказывают, что именно таким способом можно контролировать макромолекулярный препарат от момента создания в растворе до испытаний на клеточном уровне.

На молекулярном уровне метод диэлектрометрии дает возможность идентифицировать конечную структурно-функциональную организацию макромолекул. На надмолекулярном уровне он позволяет испытывать стабильность системы при определении оптимальных условий хранения с учетом факторов экстремальности. А на клеточном — выяснять механизмы действия лекарственных препаратов в живой клетке (Щеголева Т. Ю., Колесников В. Г., Дреаль Н. В., Институт радиофизики и электроники «Исследование действия биологически активных агентов на системы регуляции живой клетки радиофизическими методами как альтернатива использованию лабораторных животных в биологии, медицине и фармакологическом эксперименте»).

Если говорить об оценке влияния лекарственных средств на потомство, то здесь вырисовывается довольно мрачная картина (Девейкис Д. Н., Харьковский НИИ гигиены труда и профзаболеваний).

Для проведения исследований 1 ступени, позволяющих выявить у вещества эмбриотоксический и мутагенный эффекты, требуется не менее трех групп опытных и одной контрольной группы животных. Когда же речь заходит об изучении «результатов» действия соединения в пренатальном периоде — измененных поведенческих реакциях, нарушениях гомеостаза и репродуктивной функции индивида, то оно (изучение) получается еще более «материалоемким». Даже выжившие животные переходят в разряд «отработанного материала» и дальнейшему использованию не подлежат.

Во многих странах, чтобы хоть как-то исправить положение, функционируют банки данных соединений, обладающих токсическим влиянием на все без исключения процессы индивидуального развития, в том числе и внутриутробного развития плода. В Украине создание подобных банков лишь начинается.

В некоторых случаях определение эмбриотксичности химических веществ проводится на предимплантационных и постимлантационных культурах эмбрионов млекопитающих. Но в качестве рутинного теста использование эмбриональных тканей не получило признания ни у нас, ни за рубежом, поскольку применение чистых культур без использования систем метаболической активации не может дать адекватной картины.

Не получили широкого распространения и тесты с органными культурами, т. е. культурами, в которых поддерживается зачаток организма и при этом отслеживается его рост и специфическая дифференциация какого-то определенного органа: несмотря на всю перспективность таких тестов, они нуждаются в валидации. А она на данный момент невозможна из-за отсутствия тщательного сравнительного анализа с результатами экспериментов на животных.

Особые надежды токсикологи возлагают на исследование мембран.

По имеющимся данным, с лабилизацией мембран лизосом и эндоплазматического ретикулума и с изменением локализованных в них ферментных систем связаны механизмы реализации гонадотоксического и эмбриотоксического эффектов различных химических веществ.

Со структурными изменениями мембран, нарушающими их адгезивные свойства и межклеточные контакты, связано превращение нормальной клетки в опухолевую. И, наконец, с нарушениями структуры и функции ядерных мембран связаны все генетические нарушения на уровне целостного организма. Поэтому не исключено, что системы биологических мембран вскоре будут использоваться для оценки мутагенных, эмбриотоксических и гонадотоксических эффектов лекарственных препаратов.

Но, к сожалению, все эти тесты позволяют выявить повреждающее действие химического агента лишь на ранних этапах развития индивида.

Краткосрочных тестов для обнаружения мелких нарушений, которые могут накапливаться в процессе онтогенеза и приводить к снижению жизнеспособности популяции, ученые пока не изобрели.





© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика