Логотип журнала "Провизор"








Альтернатива БЦЖ

Л. В. Львова, канд. биол. наук

В 1984 году Игорь Леонидович Дикий, ныне профессор, завкафедрой микробиологии Национальной фармацевтической академии Украины, разработал новый способ получения вакцинных штаммов микобактерий туберкулеза.

Предложенная им вакцина имела ряд неоспоримых преимуществ по сравнению с традиционно используемой БЦЖ.

Тем не менее широкого практического применения эта вакцина не получила.

Коварство микобактерии

Возбудители туберкулеза, Mycobacterium tuberculosis — аэробные, споронеобразующие, неподвижные кислотоустойчивые палочки, не выделяют никаких эндотоксинов, экзотоксинов и гистолитических ферментов. В высушенных капельках слюны или мокроты они могут сохраняться неделями, а во влажных выделениях — месяцами.

Разнообразие существующих штаммов впечатляет — один только Нью-Йоркский институт здравоохранения располагает генетическими портретами примерно десяти тысяч штаммов микобактерий из разных стран.

Являясь строгими аэробами, микобактерии лучше всего размножаются в тканях с высоким содержанием кислорода. Именно по этой причине реактивация вторичного туберкулеза происходит в верхушках легких. В этой части легких кровь захватывает настолько мало альвеолярного кислорода, что оставшегося количества с избытком хватает для размножения бацилл. Со временем пролиферация бактерий возрастает, и запасы кислорода истощаются.

В центре казеозных очагов, лишенных кислорода, размножение бактерий резко замедляется. Но по мере прогрессирования казеоза и разрушения бронхиол доступ кислорода увеличивается, и микробы начинают размножаться с удвоенной силой.

Объективности ради надо заметить, что анаэробиоз — не единственная причина существенного уменьшения числа бактерий в очагах воспаления. Важную роль в этом процессе играет и то, что при рН 6,5 под действием липазы происходит высвобождение алифановых кислот, способных разрушать туберкулезные палочки и замедлять процесс их воспроизведения.

Что же касается патогенности Mycobacterium tuberculosis, то по современным представлениям она связана с их способностью избегать разрушения макрофагами и индуцировать гиперчувствительность замедленного типа. Этой способностью микобактерии обязаны веществам клеточной мембраны — корд-фактору, сульфатидам, гетерополисахариду LAM и высокоиммуногенному микобактериальному белку температурного шока.

Гликолипид, известный как корд-фактор, обладает вирулентными возможностями. О верности такого утверждения свидетельствуют, по меньшей мере, два факта. Во-первых, бациллы, лишенные корд-фактора, утрачивают вирулентность и, во-вторых, при введении очищенного корд-фактора мышам в месте его введения образуется типичная для туберкулеза гранулема.

Сульфатиды — поверхностные гликолипиды, содержащие серу, препятствуют слиянию фагосом макрофагов с лизосомами.

Гетерополисахарид LAM, сходный по строению с эндотоксинами грамотрицательных бактерий, имеет свою специализацию: он тормозит активацию макрофагов гамма-интерфероном. Под его влиянием макрофаги секретируют туморонекротический фактор (TNF-a) и интерлейкин-10 (IL-10). Один из них, TNF-a, стимулирует развитие лихорадки, снижение веса и повреждение тканей. Другой, IL-10, угнетает индуцированную микобактериями пролиферацию Т-лимфоцитов.

Высокоиммуногенный микобактериальный белок температурного шока, напоминающий своим строением белки температурного шока человека, играет определенную роль в аутоиммунных реакциях, вызванных микобактерией. Из-за активации поверхностного бактериального комплемента происходит опсонизация туберкулезной палочки, что существенно облегчает задачу макрофагов по ее захвату. Но ожидаемого уничтожения бактерии внутри макрофага, к сожалению, не происходит — фагоцитоз остается незавершенным.

Отечественная вакцина

Разработка оригинального вакцинного штамма «БК-Харьков» началась с анализа существующих способов получения вакцинных штаммов микобактерий туберкулеза. Вывод был однозначен: для аттенуации Mycobacterium tuberculosis целесообразно использовать антибактериальные препараты биологического происхождения, содержащие ненасыщенные жирные кислоты. При этом обмен пассируемой культуры изменится и в бактериальных клетках будут преимущественно накапливаться ненасыщенные жирные кислоты, характерные для авирулентных клеток.

На первый взгляд предъявляемым требованиям соответствовал эктерицид — водорастворимый продукт окисления рыбьего жира, обладающий бактериостатическим и бактерицидным эффектом в отношении микобактерий туберкулеза. Проведенные исследования подтвердили правильность сделанного выбора. Действительно, под влиянием невысоких, бактериально неактивных концентраций эктерицида даже при одноразовом культуральном контакте типичный биохимический обмен микобактерий изменялся. В зависимости от концентрации препарата (1%, 5%, 10% и 15% к объему выращивания) изменения проявлялись либо подавлением, либо угнетением активности дегидрогеназ, пероксидазы и каталазы — ферментов, играющих важную роль в цикле Кребса. Одновременно с этим наблюдалось повышение активности внеклеточных и внутриклеточных липаз — ферментов, расщепляющих липиды.

В дальнейшем при получении вакцинных штаммов обнаруженная перестройка баланса микобактериальных ферментов послужила химико-биологической основой нового способа аттенуации — искусственного, стойкого ослабления вирулентности микобактерий туберкулеза.

Для достижения желаемого эффекта проводилось 67–70-кратное пассирование вирулентного штамма микобактерий туберкулеза на поверхности мясо-пептонно-глицеринового бульона, содержащего последовательно повышающиеся концентрации эктерицида (табл. 1).

Схема пассирования штаммов микобактерий туберкулеза на мясо-пептонно-глицериновом бульоне в присутствии эктерицида с целью аттенуации

Концентрация эктерицида в среде (об%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Кратность пассажей 1 1 2 2 3 2 3 3 5 3 4 3 5 6 24

При такой схеме пассирования используемые концентрации эктерицида, не влияя на культуральные потенции выращиваемых штаммов, существенно (в среднем на 76%) подавляют «деятельность» цикла Кребса — основного «поставщика» энергии бактериальной клетки. Энергетическая недостаточность компенсируется активацией резервных механизмов биохимического обмена за счет утилизации липидов и жирных кислот, в том числе и содержащихся в клеточной стенке. Проявляется такое «переключение» увеличением активности внеклеточных и внутриклеточных микобактериальных эстераз. В результате всех этих изменений меняется и липидный состав пассированных штаммов. По сравнению с исходной вирулентной культурой у них значительно снижается содержание общих липидов и меняется соотношение липидных фракций — туберкулофосфатидов, ацетонорастворимых липидов, высокомолекулярных миколовых кислот и туберкуловосков (схема).

Схема 1

Принципиальная схема последовательных изменений в биохимическом обмене и в химическом составе микобактерий туберкулеза при аттенуации

 

 

Надо заметить, что способ получения вакцинных штаммов был проверен на шести различных штаммах микобактерий туберкулеза. И во всех случаях эктерицид вызывал однотипные изменения химических, биохимических и иммунологических свойств, которые сохранялись в последующих поколениях микобактерий. (Наследственную необратимость изменений подтвердило многолетнее повторное культивирование пассированных штаммов на элективных питательных средах и параллельные многократные пассажи через организм морских свинок и белых мышей.)

Для более детального исследования был выбран пассированный вариант вирулентного референс-штамма УаIIее (впоследствии он был зарегистрирован под авторским названием «БК-Харьков»).

Как выяснилось, этот штамм обладает многими положительными свойствами.

Штамм «БК-Харьков» персистирует в организме ограниченное время. Он не вызывает специфической клеточно-тканевой реакции ни в зоне введения; ни во внутренних органах. Остаточная вирулентность «БК-Харьков» в восемь раз ниже, чем у БЦЖ. По сравнению с БЦЖ он гораздо больше подвержен завершенному фагоцитозу «неиммунными» макрофагами здоровых, невакцинированных животных. Аллергенные свойства «БК-Харьков» слабо выражены. Причем поствакцинальная аллергия, вызванная введением, после окончания иммунизаторного периода начинает постепенно угасать.

Первичная фиксация и «приживление» бактериальных клеток «БК-Харьков» и БЦЖ во внутренних органах животных осуществляются по-разному.

При введении штамма «БК-Харьков» дело ограничивается развитием во внутриорганных зонах фиксации макрофагальной реакции без образования эпителиоидных и гигантских клеток. Это означает, что активированные макрофаги способны к уничтожению (или, по выражению специалистов, завершенному фагоцитозу) первично фиксированных вакцинных бактерий.

При введении БЦЖ ситуация совсем иная. После вакцинации в органах животных отмечается интенсивное образование и нарастающая пролиферация эпителиоидных клеток, фиксирующих БЦЖ в зоне «приживления» и фагоцитирующих их по незавершенному типу. (Макроскопически это проявляется формированием специфических бугорков.) Со временем на смену эпителиоидным клеткам приходят макрофаги и гигантские клетки. Поэтому не исключено, что эпителиоидные клетки уменьшают остаточную вирулентность БЦЖ и тем самым облегчают задачу макрофагов и гигантских клеток по уничтожению вакцинных клеток. В пользу такого предположения говорит то, что с появлением макрофагов и гигантских клеток микроскопическая картина бугорков постепенно нормализуется.

Различие иммунологических свойств «БК-Харьков» и БЦЖ, по всей вероятности, связаны с особенностями липидного состава этих вакцинных штаммов и, прежде всего, с пониженным содержанием туберкулофосфатидов и некоторых типов туберкуловосков в штамме «БК-Харьков» (табл. 2). Основано такое допущение на нескольких хорошо известных фактах.

Таблица 2

Липидный состав вакцинных штаммов — «БК-Харьков» и БЦЖ

Липидный состав (г/л) БЦЖ «БК-Харьков» Содержание липидных фракций «БК-Харьков» относительно БЦЖ (%)
Общие липиды 332,8 232,3 69,8
Туберкулофосфатиды 307,5 183,3 59,6
Ацетонорастворимые липиды 17,3 32,5
Хлороформорастворимые липиды 8,0 16,5
Туберкуловоски 121,3 119,4
Тип «А» 31,4 84,1
Тип «В» 44,6 23,8 53,3
Тип «С» 24,0 3,8 13,7
Тип «D» 21,3 8,4 39,4

Во-первых, туберкулофосфатиды в месте введения способны вызывать формирование эпителиоидно-клеточных узелков, подвергающихся центральному казеозу. При внутривенном введении с их «помощью» развивается генерализованное поражение специфическими гранулемами бронхопульмональных лимфатических узлов, легких, печени и других внутренних органов, а при внутрилегочном введении — образование каверн.

Во-вторых, воск С, входящий в состав корд-фактора, несет ответственность за кислотоустойчивость, вирулентность и токсичность туберкулезных бактерий. В-третьих, воск В способен повышать восприимчивость животных к туберкулезу. В-четвертых, воск D в месте введения может вызывать воспаление и образование гигантоклеточных и эпителиоидноклеточных гранулем, а при внутривенном введении — формирование каверн. Помимо этого он может индуцировать аллергические реакции немедленного и замедленного типов, в том числе аллергические диссеминированные энцефаломиелиты и артриты.

Механизм формирования иммунитета при введении «БК-Харьков» и БЦЖ практически одинаков и сводится к стимуляции специфической и неспецифической противотуберкулезной защиты.

Однако стимулирующее влияние вакцинного штамма «БК-Харьков» на фагоцитарную функцию лейкоцитов и макрофагов выражено гораздо ярче: через два месяца после вакцинации «БК-Харьков» у морских свинок наблюдалось пятикратное возрастание способности перитональных макрофагов к завершенному фагоцитозу и трехкратное повышение фагоцитарной активности в сравнении с теми же параметрами морских свинок, вакцинированных БЦЖ. Причем после вакцинации «БК-Харьков» лейкоциты и макрофаги сохраняют высокую активность по крайней мере в течение девяти последующих месяцев. Стимулирующее действие БЦЖ проявляется лишь в первые два-три месяца после вакцинации.

Выявленные различия «БК-Харьков» и БЦЖ можно объяснить следующим образом.

Многочисленные исследования убедительно доказали, что иммунизация увеличивает активность макрофагов лишь в отношении тех возбудителей, из которых была приготовлена вакцина. В частности, фильтраты макрофагов животных, вакцинированных БЦЖ бактерицидно активны исключительно в отношении микобактерий туберкулеза. Для стафилококка они никакой опасности не представляют.

Словом, специфический бактериотропизм «иммунных» макрофагов налицо. И обусловлен он, по-видимому, тем, что «захват» возбудителя, инициированный вакцинацией, для захватчика-макофага, впрочем, как и для самого микроорганизма, не проходит бесследно.

По иронии судьбы, попав внутрь макрофага, возбудитель мобилизует макрофагальные ферменты, способные его уничтожить — макрофаг переходит в «иммунное» состояние.

Химический состав вакцинного штамма БЦЖ (в том числе липидный состав клеточных оболочек) и вирулентных микобактерий не имеют существенных отличий. Поэтому «иммунный» макрофаг, стремясь преодолеть мощную липидную оболочку, начинает «наращивать» активность эстераз. Но, к сожалению, физиологический «потолок» ферментативной активности не позволяет довести начатое дело до конца и разрушить бактериальную клетку. Иными словами, действие вакцинация БЦЖ сводится к повышению устойчивости макрофагов к деструктивному действию фагоцитированных бактерий. Сами же «иммунные» макрофаги не способны к завершенному фагоцитозу клеток БЦЖ и вирулентных микобактерий.

В клетках штамма «БК-Харьков» структурных липидов намного меньше, чем в БЦЖ (табл. 2). Это создает благоприятные условия для липолитической обработки фагоцитированных клеток «БК-Харьков» и для активации определенных макрофагальных ферментов. Словом, вакцина «БК-Харьков» оказывает более выраженное воздействие на фагоцитарную функцию макрофагов, что, скорее всего, и обеспечивает более высокий уровень поствакционального иммунитета, сообщаемого этой противотуберкулезной сывороткой.

Высокая эффективность вакцины «БК-Харьков» была подтверждена в опытах на животных: через два месяца после вакцинации практически у всех морских свинок и кроликов отмечалась невосприимчивость к вирулентным культурам микобактерий, тогда как защитный эффект БЦЖ не превышал 89,5% (табл. 3). Различия в выраженности протективного эффекта двух вакцин в отдаленные сроки после вакцинации тоже свидетельствовали в пользу «БК-Харьков» (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительные данные об иммуногенной активности «БК-Харьков» и БЦЖ при экспериментальном туберкулезе

Вакцина Показатели невосприимчивости Срок между вакцинацией и разрешающим заражением
Морские свинки (модель генерализованной инфекции) Кролики (модель менингита)
3
месяца
5
месяцев
7
месяцев
9
месяцев
2
месяца
4
месяца
6
месяцев
«БК-Харьков» выживаемость (%) 100 100 88,8 82,3 100 80 80
индекс поражения 0,45 0,85 2,55 2,90 0,40 1,20 1,70
индекс высеваемости 0 0,20 0,70 1,80 0,20 0,90 1,40
БЦЖ выживаемость (%) 89,5 75,0 66,8 55,0 60,0 20,0 0
индекс поражения 4,0 7,40 7,25 13,20 2,20 2,40 2,80
индекс высеваемости 2,40 4,45 4,05 10,20 1,0 1,80 2,20

Производственные испытания на поголовье крупного скота в эпидемиологически неблагополучных районах подтвердили высокую эффективность вакцины и положительные свойства вакцины «БК-Харьков», обнаруженных в ходе экспериментальных исследований — ее специфическую безвредность и слабую аллергенность, биологически нивелированную остаточную вирулентность и ограниченное во времени персистирование вакцинных клеток в организме телят.


P.S. Производственные испытания стали заключительным этапом многолетней работы. Финансирование дальнейших исследований было прекращено, поскольку в СССР, впрочем, как и во многих западноевропейских странах, царила эйфория по поводу победы над туберкулезом. К тому же, тогда у нас бытовало мнение, что никакой альтернативы БЦЖ нет и быть не может.

Сейчас туберкулез превратился в «глобальную угрозу XXI века». Для большинства жителей Украины лечение туберкулеза — непозволительная роскошь (по самым скромным подсчетам стоимость лечения составляет 5000$).

Так что самое время вернуться к работе над отечественной сывороткой. Первые шаги в этом направлении уже сделаны.





© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика