Логотип журнала "Провизор"








И. К. Палий

Метрологическая характеристика альфа-два-интерферона, полученного по новой технологии

Винницкий государственный медицинский университет им. Н. И. Пирогова

Биотехнология в развитых странах находится на этапе бурного развития, что обусловлено повышением инвестиционной активности государственных и коммерческих учреждений в научную и промышленную сферу. Необходимо подчеркнуть, что сейчас в мире происходит активное распределение рынков и сфер научно-технической и коммерческой деятельности на перспективу в третьем тысячелетии. Аналитики прогнозируют увеличение мирового рынка биотехнологической продукции в 2000 г. до $200 млрд, в том числе лекарственных препаратов медицинского назначения — до $43 млрд [1–4]. Cегодня наиболее рентабельной сферой биотехнологии являются фармакотерапевтические лекарственные средства, к которым относится генно-инженерный альфа-два-интерферон с коммерческим названием виаферон (Viaferonum) — (ВФС 42У-23/60-439-97; ВФС 42У-23/60-440-97).

Известны три группы человеческих интерферонов (лейкоцитарный — альфа; фибробластный — бета; иммунный — гамма), которые обладают противовирусным, антипролиферативным, иммуномодулирующим действием [7]. Названные выше свойства интерферонов справедливо вызывают большой интерес у биологов и врачей различных специальностей. До настоящего времени эти средства не нашли, однако, широкого применения из-за ограниченного производства из дорогого природного сырья (лейкоциты донорской крови).

Виаферон является весьма перспективным биотехнологическим лекарственным препаратом для крупномасштабного производства, являясь рекомбинантным интерфероном. Виаферон (рекомбинантный альфа-два-интерферон) был разработан на Ладыженском государственном предприятии “Энзим”, там же освоен его промышленный выпуск. Всестороннее исследование виаферона проведено в Винницком государственном медицинском университете им. Н. И.Пирогова МЗ Украины, Киевском научно-исследовательском институте эпидемиологии, инфекционных болезней им. Л. В. Громашевского МЗ Украины [5, 6, 8]. Виаферон получили путем внесения в состав плазмиды клетки Pseudomonas species VG-3 генов человеческого лейкоцитарного альфа-два-интерферона.

Лекарственный препарат Виаферон соответствует ВФС 42У-23/60-440-97, имеет ряд компонентов в своем составе на одну ампулу, а именно:

Альфа-2-интерферона человеческого рекомбинантного (ВФС 42У-23/60-439-97) 1 млн МЕ
Альбумина донорского (ВФС 42-854-79) или альбумина плацентарного (ВФС 42-1104-81) 5,0 мг
Сахара молочного (ГФ Х, статья 589) или альфа-D-лактозы-1-водной (ТУ 6-09-2293-79) 10,0 мг

Виаферон представляет собой пористую массу белого цвета, легко растворимую в воде и растворе натрия хлорида 0,9% [9]. Для определения подлинности виаферона содержимое одной ампулы разводят модифицированной средой 199 так, чтобы в конечном растворе содержалось не менее 20 МЕ/мл противовирусной активности, смешивают равные объемы препарата и раствора, инкубируют смесь в течение 40 мин. при температуре 37 ± 1оС.

Противовирусную активность смеси виаферона определяли по степени защиты, создаваемой препаратом от цитопатогенного действия (ЦПД) индикаторного вируса везикулезного стоматита (ВВС) в перевиваемой культуре клеток L-41 по общепринятой методике. За величину противовирусной активности виаферона принимали его титр, т. е. обратное значение максимального разведения препарата, которое вызывало 50% подавление ЦПД ВВС по сравнению с контролем.

Пересчет активности в международных единицах (Х) проводили по формуле:

X = TО x (AОСО / TОСО) x N,

где То — титр препарата; Тосо — титр отраслевого стандартного образца; Аосо — активность отраслевого стандартного образца в МЕ; N — исходное разведение виаферона.

Установлено, что противовирусная активность виаферона была не менее 1 х 106 МЕ в одной ампуле.

Количественное определение белка в виафероне выполняли колориметрическим методом по Лоури, который основан на измерении оптической плотности окрашенных продуктов. В результате осуществления одновременно двух цветных реакций на белок происходило взаимодействие белка с компонентами соответствующего реактива за счет биуретовой реакции ионов меди в щелочной среде на пептидную связь. Вторая цветная реакция наступала за счет восстановления фенольного реактива Фолина.

Для определения белка содержимое одной ампулы виаферона растворяли в 1 мл дистиллированной воды. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора рабочего стандартного образца (РСО), обработанного аналогично испытуемому раствору.

Приготовление раствора РСО белка с концентрацией 0,1 мг/мл проводят следующим способом: 0,1000 г (точная навеска) яичного альбумина (ТУ 6-09-4477-77) в пересчете на сухое вещество помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора дистиллированной водой до метки и перемешивали. При температуре 4–10оС срок годности РСО белка составлял 3 сут. Затем 5 мл этого раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили до метки и перемешивали. Раствор использовали свежеприготовленным.

Содержание белка (К) в мг на мл препарата вычисляли по формуле:

K = (D x 0,1 x 1) x N / (Do x 1) =  D x 0,1 x N /  Do,

где D — оптическая плотность исследуемого раствора; Do — оптическая плотность раствора РСО белка; 0,1 — содержание белка в растворе РСО белка, мг/мл; 1 — объемы исследуемого раствора и раствора РСО белка, мл; N — разведение исследуемого раствора.

Содержание белка в виафероне должно быть от 4,5 до 5,0 мг/мл.

Результаты проведенных исследований иллюстрирует таблица 1.

Таблица 1. Метрологическая характеристика количественного определения белка в образцах пяти серий лекарственного препарата «Виаферон»
Серия f x S x Р,% t (P,f) Е,%
07.09.97 4 4,66 1,245 х 10-2 95 2,78 3,461 х 10-2 0,743
08.10.97 4 4,84 1,466 х 10-2 95 2,78 4,076 х 10-2 0,842
10.11.97 4 4,76 1,162 х 10-2 95 2,78 3,230 х 10-2 0,679
15.12.97 4 4,55 1,072 х 10-2 95 2,78 2,980 х 10-2 0,655
17.01.98 4 4,76 1,225 х 10-2 95 2,78 3,405 х 10-2 0,715

Из данных таблицы 1 следует, что содержание белка в лекарственном средстве виафероне было стабильным. Математико-статистический анализ результатов для 4 параллельных определений образцов 5 серий не превышал 0,85% с надежностью р — 0,95.

Определение активности виаферона (альфа-два-интерферона) проводили по методике твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Опыты выполняли в луночных полистирольных планшетах с плоским дном (ТУ 64-2-278-79). В каждую лунку планшета № 1 вносили по 50 мкл рабочего раствора кроличьих поликлональных антител против альфа-два-интерферона. Планшет инкубировали в термостате при 37оС в течение 60 мин.

В каждую лунку планшета № 2 вносили по 50 мкл буферного раствора для раститровки проб. В каждую лунку с буфером вносили по 50 мкл раствора виаферона.

Содержимое одной ампулы растворяли в 1 мл дистиллированной воды и титровали с разведением 1:2. Опыт ставили с каждым разведением виаферона четырехкратно для получения статистически достоверных результатов. В ряде лунок выполняли раститровку рабочего раствора отраслевого стандартного образца (ОСО 42-28-119-87). Опыты сопровождали соответствующими контролями. Затем в каждую лунку планшета № 2 вносили по 25 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител к альфа-два-интерферону с пероксидазой хрена.

По окончании инкубации содержимое лунок в планшете № 1 удаляли и промывали 3 раза буферным раствором. Из лунок планшета № 2 содержимое переносили в лунки планшета № 1 по 50 мкл. После этого планшет № 1 инкубировали при 37оС в течение 120–150 мин. После инкубации содержимое лунок удаляли и трехкратно промывали буферным раствором для промывок и 1 раз дистиллированной водой.

Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл свежеприготовленного раствора субстрата и выдерживали 10–15 мин. в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали путем внесения в лунки по 50 мкл 20% раствора серной кислоты.

Измерение оптической плотности на спектрофотометре выполняли при длине волны 490 нм. На основании полученных данных оптической плотности рабочего раствора ОСО строили калибровочную кривую зависимости оптической плотности от активности виаферона в МЕ/мл. Определение активности виаферона проводили по калибровочной кривой с учетом разведений препарата в каждой лунке. Затем определяли среднее значение активности препарата. Полученные данные суммированы в таблице 2.

Таблица 2. Метрологическая характеристика количественного определения интерферона методом твердофазного иммуноферментного анализа в лекарственном препарате «Виаферон»
Серия f x S x Р,% t (P, f) dx Е, %
07.09.97 4 1,02 х 106 1,183 х 104 95 2,78 3,289 х 104 3,225
08.10.97 4 1,03 х 106 0,8366 х 104 95 2,78 2,326 х 104 2,258
10.11.97 4 1,054 х 106 0,9798 х 104 95 2,78 2,724 х 104 2,584
15.12.97 4 1,05 х 106 0,949 х 104 95 2,78 2,637 х 104 2,512
17.01.98 4 1,044 х 106 1,503 х 104 95 2,78 4,179 х 104 4,003

Как видно из результатов опытов, представленных в таблице 2, концентрация интерферона в готовом лекарственном средстве виаферон была не менее 1,02 х 106 МЕ. С помощью метода математической статистики установлено, что относительная погрешность метода не превышала 4,01%.

Следует подчеркнуть, что твердофазный иммуноферментный анализ виаферона основан на взаимодействии альфа-два-интерферона как антигена с моноклональными антителами к этому препарату с последующим спектрофотометрическим измерением оптической плотности окрашенного ассоциата альфа-два-интерферона с конъюгатом пероксидазы и моноклональных антител.

Таким образом, производственные образцы виаферона характеризуются стабильным содержанием белка, активностью альфа-два-интерферона и соответствуют требованиям нормативной документации.

Литература

  1. Фролов А. Ф., Вовк А. Д., Дядюн С. Т. и др. Эффективность рекомбинантного альфа-два-интерферона при вирусном гепатите В//Врачебное дело.— Киев, 1990.— № 9.— С. 105–108.
  2. Подымова С. Д., Буеверов А. О. Интерфероны в лечении хронических вирусных гепатитов//Терапевтический архив.— М., 1996.— № 11.— С. 74–76.
  3. Malaguarnera M., Restuccia S., Motta M. Interferon, Cortisone and Antivirals in the Treatment of Chronic Viral Hepatitis: A Review of 30 Years of Therapy//Pharmacotherapy.— 1997.— № 17 (5).— Р. 998–1005.
  4. Волянский Ю. Л., Васильев Н. В., Москаленко В. Ф. и др. Эпидемиологические и иммунопатологические аспекты вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции.— Х.: Изд-во АО “Бизнес Информ”, 1997.— 208 с.
  5. Временная фармакопейная статья 42У-23/60-439-97. Интерферон человеческий рекомбинантный альфа-два.
  6. Временная фармакопейная статья 42У-23/60-440-97. Виаферон.
  7. Покровский В. И., Змызгова А. В., Мурзабаева Р. Т. и др. Изучение реактогенности, токсичности и переносимости реаферона на здоровых добровольцах//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии (ЖМЭИ).— М., 1988.— № 1.— С. 69–73.
  8. ОСТ 42У-1-92. Порядок разработки, согласования и утверждения нормативно-технической документации на лекарственные средства и лекарственное растительное сырье.
  9. Государственная Фармакопея СССР. ХI изд., вып.1.— С. 175.




© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика