Логотип журнала "Провизор"








Л. В. Львова,
кандидат биологических наук

Поиск продолжается

журнал «Провизор»

Вирусы, бактерии, споры... Борются с ними различными способами давно и упорно, но не всегда успешно. И поиск продолжается. В центре внимания — цитостатические и цитоцидные свойства, механизмы повреждения и защиты микроорганизмов.

Химическая атака

Дезинфицирующих средств — великое множество: хлорсодержащие вещества и четвертичные-аммониевые соединения, поверхностно-активные вещества и пероксисоединения, альдегиды и соли металлов.

Известно, что ионы некоторых металлов обладают бактерицидными свойствами, и ярче всего они выражены у ионов серебра. Так, мизерное содержание азотнокислого серебра (всего 2 х 10-6 моль/л) в питательной среде Sacharomyces cerebisial способно остановить рост культуры, а несколько большее количество (5 х 10-6 моль/л) может привести к полному уничтожению всех клеток. Цитостатическое и цитоцидное действие ионов Сu2+ и Сr6+ менее эффективно, но при их совместном применении появляется синергический эффект, и таким образом на порядок снижаются цитостатические и цитоцидные дозы. Бактерии научились защищаться от губительного действия ионов Сu2+ и Сr6+. К примеру, Acinobacter sr. использует для этого экзополисахариды, и если поблизости есть бактерии, способные ассимилировать эти полисахариды, то и у них повышается устойчивость к действию ионов. Интересно и то, что аналогичный эффект наблюдается и по отношению к формальдегиду.

Борьба с «госпитальной» инфекцией, несмотря на обилие дезинфицирующих средств, по-прежнему остается очень важной проблемой. На первый взгляд, все просто — нужно подобрать препарат и время обработки. Но здесь-то и возникают трудности. Оказалось, что по отношению к золотистому стафилококку, Е. соli, вирусам гриппа и парагриппа наибольшей эффективностью обладали хлорсодержащие препараты. При инактивации спор лучше всего себя зарекомендовали фенол и формальдегид. Активность композиционных препаратов хлордезина и сульфохлорантина (у них активно действующими веществами являются калиевая соль дихлоризоциануровой кислоты и дихлордиметилгидантоген) менялась в зависимости от времени обработки. По отношению к золотистому стафилококку, вирусам гриппа и парагриппа при обработке в течение нескольких минут (t = 5 мин.) эффективность композиционных препаратов была ниже, а с увеличением времени обработки (t = 30 мин., t = 60 мин.) — выше, чем у индивидуальных препаратов. С Е. coli и спорами дело обстояло иначе. Эффективность сульфохлорантина по отношению к Е. coli и спороцидное действие хлордезина уменьшались с возрастанием длительности обработки.

Перекись водорода давно и успешно используется в качестве дезинфицирующего средства, но среди ста штаммов спорообразующих бактерий нашлось немало резистентных. Некоторые не только выжили в присутствии 3–6% перекиси, но и продолжали размножаться. А вот действие дезоксона-1 (да и то в течение пяти минут) смог выдержать только один штамм из ста.

Определенную лепту в госпитальную инфекцию вносят некоторые штаммы Ps. aeruginosa, Citobacter, Klebsiela и Enterobacter. И настолько они приспособились к жизни, что приобрели устойчивость к бактерицидным концентрациям хлорамина, рассчитанным по тест-штаммам Е. coli и Staph. aureus. Изучение действия различных препаратов позволило разработать некоторые критерии, полезные при оценке возможностей нового средства. Для сравнения с эталонным веществом удобно пользоваться соотношением:

А отн. = (СЭi) x t,

где
А отн. — относительная активность исследуемого вещества;
СЭ — концентрация эталонного вещества, вызывающая гибель микроорганизмов за время t;
Сi — концентрация исследуемого вещества.

Для более полной характеристики полезно оценить избирательность действия нового препарата с помощью

Kид. = (СЭi) x t,

где
Кид. — коэффициент избирательного действия;
СЭ — концентрация вещества, вызывающего полную гибель микроорганизмов, принятых за эталон
Сi — концентрация того же вещества, вызывающая равный микробицидный эффект за одинаковое время при воздействии на t-й (сравниваемый организм).

Активность и степень избирательного действия зависит и от вида микроорганизмов (вирус, спора, бактерия), и от времени обработки. Количественные значения этих показателей облегчают выбор наиболее эффективного препарата.

Противомикробные свойства химических веществ во многом зависят от механизма их воздействия на микроорганизмы, но зачастую механизм повреждения не совсем понятен. Хорошо известно, что поверхностно-активные вещества (ПАВ) влияют на цитоплазматическую мембрану бактерии, но к чему это приведет в конкретном случае, сказать трудно. Возможны несколько вариантов: нарушение активного транспорта метаболитов, нарушение синтеза белка, нарушение процесса деления клетки, нарушение процесса преобразования энергии,— каждый из которых может вызвать инактивацию бактерии.

Противомикробные свойства четвертичных аммониевые соединений (ЧАС) обусловливают гидрофильные полярные четвертичные аммониевые группы и гидрофобные углеводородные радикалы. Устойчивость к ЧАС тесно связана с «возрастом» клеток, так как при переходе культуры из экспоненциальной фазы в стационарную увеличивается содержание липополисахаридов в клеточной стенке E. coli. Такая защита обеспечивает повышение устойчивости. Но в то же время клетки B. cereus в стационарной фазе более чувствительны к действию ЧАС, чем в экспоненциальной. С чем это связано — не понятно. Чем выше поверхностная активность ЧАС, тем ярче проявляются противомикробные свойства. Эти вещества обладают способностью встраиваться в цитоплазматическую мембрану, что приводит к изменениям в липидном комплексе. В результате из клетки уходят цитоплазматические компоненты, снижается активность некоторых бактериальных ферментов, функционально связанных с конформационным состоянием липидного комплекса цитоплазматической мембраны. При очень высоких концентрациях ЧАС мембрана деструктурируется из-за того, что липиды «покидают» ее, образуя мицеллы с ЧАС (рис. 1).

lvova1.gif (1696 bytes)
рис. 1. Мицеллы ПАВ «захватывают» мембранные липиды

Эффективность альдегидов обеспечивает группа

обладающая высокой реакционной способностью. Реагируя со свободными NH и NH2 группами белков, она соединяет белковые цепи, что нарушает их функционирование. Кроме того, альдегиды могут быть причиной однонитевых разрывов ДНК и образования сшивок между белком и ДНК. Налицо непосредственное действие на ген микроорганизма.

С воздействием на генетический аппарат бактерий связаны и противомикробные свойства ионов металлов. Cu2+ является причиной однонитевых и двунитевых разрывов ДНК и образования сшивок между белком и ДНК. Ионы Cr (II, III, IV) вызывают однонитевые разрывы ДНК, инициируют образование сшивок между азотистыми основаниями ДНК и между белком и ДНК.

Пероксисоединения, к примеру перекись водорода, вызывают перекисное окисление липидов (ПОЛ), последствия которого для клетки могут быть весьма печальными. Наиболее уязвимы для повреждающего агента ненасыщенные жирные кислоты. Появление в них гидрофильной гидроперекисной группировки уменьшает гидрофобность мембранных липидов и тем самым увеличивает проницаемость мембраны для ионов. В результате ПОЛ могут возникнуть нарушения в мембраносвязанных процессах (к примеру, окислительное фосфорилирование), а образование белок-липидных комплексов может значительно изменить активность мембраносвязанных белков.

В окислительную инактивацию мембран может вносить вклад и образование сшивок между мембранными белками по аминогруппам (NH2). Такое явление, в частности, наблюдали у E. сoli.

Вместе с тем, клетки могут «защищаться» от действия повреждающих агентов. В зависимости от обстоятельств функции «защитников» берут на себя антиоксиданты, ферменты или репарационные процессы.

Опытным путем удалось показать, что тиомочевина, являясь антиоксидантом, блокирует агрегацию мембранных белков E. сoli, взаимодействуя амингруппами с карбоксильными группами белков.

Ферменты, в частности каталаза, способна защитить клетки бактерий только от внешних источников активного кислорода. Об этом свидетельствуют следующие факты. После обработки E. сoli перекисью водорода у них стимулировалась экспрессия генов, отвечающих за синтез каталазы. Когда такой источник удалось получить в липофильной части мембраны — каталаза была бессильна.

Причиной генетических нарушений могут стать и химические, и физические агенты. Но, как известно, «всякое действие вызывает противодействие», и бактерии научились избавляться от модифицированных и неправильно спаренных азотистых оснований, однонитевых и двунитевых разрывов ДНК, внутри и межмолекулярных сшивок ДНК и сшивок ДНК-белок с помощью репарации. Репарация бывает сверхбыстрая (срабатывает всего за 30 с), быстрая (проходит за 2 мин.) и медленная (на нее клетка затрачивает от 30 до 60 мин.). Суть ее —удаление повреждения и «залечивание» образовавшейся бреши. Процесс имеет несколько этапов. В начале эндонуклеаза узнает поврежденный участок ДНК и разрезает цепь ДНК вблизи повреждения.

Работу продолжает экзонуклеаза, вырезая участок ДНК с повреждением.

Репликативная ДНК-полимераза застраивает образовавшуюся брешь, используя одноцепочечный участок ДНК в качестве матрицы.

Завершает процесс ДНК-лигаза, которая «сшивает» новый участок со старым материалом.

Физические агенты в действии

Активность бактериальных клеток, спор и вирусов в жидких средах может снижаться под воздействием тепла и yльтpaфиoлетового облучения.

Для инактивации спор нужна более высокая температура, чем для разрушения вегетативных клеток, поскольку образование эндоспор, являясь защитным механизмом, позволяет клетке переносить неблагоприятные условия. Причиной гибели каждой конкретной клетки может, по-видимому, стать денатурация жизненно важных биомолекул — ДНК и белков. Причем кинетика процесса зависит не только от температурного и временного режимов обработки, но и от содержания растворителя. К примеру, снижение содержания воды в растворе яичного альбумина от 50% до 5% приводило к повышению температуры коагуляции от 56°С до 149°С. Этот факт наводит на мысль о том, что при инактивации обезвоженных организмов и структур (вирусов или спор) сначала происходит гидратация, а потом уже инактивация. Именно такому механизму соответствует экспериментально установленная зависимость скорости гибели бактериофагов от относительной влажности. Однако в некоторых случаях совместное действие двух повреждающих факторов менее эффективно, чем можно было предположить по эффективности каждого из них.

Популяция бактерий обычно состоит из клеток разного возраста. Они имеют свои физиологические особенности, а следовательно, обладают различной устойчивостью к действию высоких температур. В частности, в фазе экспоненциального роста увеличивается проницаемость клеточных стенок, что способствует интенсивному обмену между внутриклеточным объемом и средой. Если поступающие в клетку вещества могут повысить термоустойчивость белков, то, скорее всего, их присутствие приведет к росту клеток. Количественно оценить этот эффект, да и некоторые другие, практически’ невозможно. Отсюда и отсутствие математического описания кинетики гибели клеток, которое позволило бы с высокой степенью достоверности подобрать режимы тепловой обработки для конкретного случая. Тем большее значение имеют экспериментальные исследования.

При изучении действия термической обработки на вегетативные формы E. coli и S. aureus выяснилось, что тепловая гибель клеток в каждой культуре имеет свои особенности. Этот факт нашел отражение в характере изменения численности популяции при увеличении времени обработки — скорость тепловой гибели Е. coli оставалась неизменной, а S. aureus изменялась с течением времени (рис. 2).

рис 2.а
рис. 2.а Тепловая гибель клеток S. aureus

рис. 2б
рис. 2.б Тепловая гибель клеток E.coli

Похожая картина наблюдалась и в случае тепловой инактивации Bac. subtilis и B. stearothermophils. Споры Bac. subtilis гибли медленнее, чем споры B. stearothermophils, зато с постоянной скоростью, Кстати, как и ожидалось, и те и другие инактивировались при более высоких температурах по сравнению с бактериями (рис. 3).

рис. 3а
рис. 3а. Тепловая гибель спор Bac. subtilis

рис. 3б
рис. 3б. Тепловая гибель спор Bac. stearothermophils

Для бактерий и вирусов при определенных условиях губительно воздействие ультрафиолетового облучения (УФО). Инактивирующий эффект УФО часто связывают с образованием уридиновых димеров, разрывом полинуклеотидных цепей и формированием ковалентных связей между РНК и белком. Значение каждого фактора во многом определяется принадлежностью вируса к определенному семейству. Но, по логике вещей, УФО должно влиять и на белки, входящие в состав оболочки вируса. Оказалось, что такое предположение справедливо.

На облучение (W = 2.668 • 103 эрг/мм) белки вируса гриппа реагировали по-разному. Гемагглютелин не претерпевал никаких изменений. Активность нейроаминидазы снижалась на 18% в результате частичной деградации, вызванной фотоповреждениями. Уменьшалась на 8% и активность РНК-полимеразы, но причиной этого было образование ковалентных связей между ферментом и РНК.

Наибольшая бактерицидная эффективность присуща коротковолновому ультрафиолетовому излучению (250 нм). К такому выводу пришли при изучении влияния облучения на различные штаммы Bacillus subtilіs. Повреждающее действие связали с фотодинамическим эффектом, при котором в роли посредников выступили вещества-сенсибилизаторы (ими могут быть ферменты, пигменты, метаболиты). Под действием излучения образовывались радикалы с высокой реакционной способностью. Результатом фотодинамического эффекта на уровне ДНК были окисленные остатки гуанина, разрывы цепей и сшивки ДНК с белком. Синтез другого азотистого основания — тимина — блокировался, и таким образом нарушался процесс репликации ДНК. В этом случае механизм репарации не срабатывал.

Показано, что активность репарационных процессов в значительной мере зависит от метаболического и энергетического статуса клетки. Добавление в питательную среду ингибитора синтеза АТФ либо исключение из нее глюкозы — основного источника углерода — приводило к снижению антимутагенной активности. Аналогичный эффект наблюдался при прекращении аэрации Bacillus subtilіs, которые предварительно были подвергнуты действию УФО. У Е. coli при тех же обстоятельствах антимутагенная активность не снижалась. Объяснить наблюдаемое явление можно наличием некого механизма, отвечающего за «рачительное» использование энергетических запасов клетки.

У аэробов при малом содержании кислорода блокируется система окислительного фосфорилирования и прекращается образование АТФ. Поскольку на синтез белка расходуется много энергии, энергоснабжение репарационного процесса уменьшается, «залечивание» повреждений ДНК идет медленнее.

Многочисленные эксперименты свидетельствуют: эффективность повреждающего агента, будь то химическое вещество или физический фактор, зависит от «межклановых» различий (то есть различий между вирусами, бактериями и спорами) и «внутриклановых» различий, от «возрастных» особенностей и генетически детерминированных свойств определенных штаммов бактерий. Но роль каждого фактора в формировании повреждений и защитных реакций у микроорганизмов пока еще не совсем понятна. Поиск продолжается.





© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика