Логотип журнала "Провизор"








Шовковый А. В., Шеин А. Т., Попова Т. П.,
Литвиненко В. И., Ковалев И. П.

Применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для анализа флавоновых глюкуронидов в надземной части шлемника байкальского

Шлемник байкальский традиционно используется в народной медицине многих стран. В разных странах мира из надземных и подземных органов шлемника байкальского готовят порошки, настои, отвары, сборы, настойки и экстракты, которые достаточно широко используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, нарушений деятельности центральной нервной системы, при ряде инфекционных заболеваний, а также в качестве тонизирующего и общеукрепляющего средства [2].

Основным сырьем для производства лекарственных препаратов являются корни шлемника байкальского [2]. Анализ торговых образцов корней шлемника, проведенный с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) показал, что в них содержится от 7,0 до 8,6% байкалина и от 2,3 до 4,6% вагонозида, а также агликоны байкалеин и вагонин в следовых количествах [2].

Флавоноидный состав надземной части шлемника байкальского представлен более 20 веществами агликоновой и гликозидной природы [2]. Из агликонов идентифицированы хризин, байкалеин, апигенин, лютеолин, скутеллареин, изоскутеллареин, динатин, сальвигенин, картамидин (дигидроскутеллареин) и изокартамидин (дигидроизоскутеллареин). Упомянутые агликоны большей частью находятся в форме 7-О-глюкуронидов, которым сопутствуют 6- и 8-О-глюкурониды, а также О-гликозиды. Общее содержание флавоноидов в надземной части, определенное спектрофотометрически, такое же как и в корнях, и достигает 10–12% [5].

Cведения о содержании отдельных флавоновых глюкуронидов в надземной части шлемника байкальского в литературе отсутствуют.

Целью работы являлась разработка метода ВЭЖХ, который позволил бы провести идентификацию флавоновых глюкуронидов, выделенных из надземной части шлемника байкальского, по отдельным компонентам и определить их процентное соотношение как в сумме флавоновых глюкуронидов, так и в сумме глюкуронидов в виде водорастворимых солей с L-лизином.

Объекты и методы исследования

При разработке метода анализа были использованы образцы апигенин-глюкуронида, байкалеин-глюкуронида (байкалина), лютеолин-глюкуронида, скутеллярин-глюкуронида и хризин-глюкуронида, предоставленных лабораторией ХТПФ ГНЦЛС. Этой же лабораторией была предоставлена одна из фракций наземной части шлемника байкальского.

Для получения инъекционной лекарственной формы, гелей, а также повышения биодоступности и уменьшения токсичности флавоноидов в лаборатории физико-химических процессов ГНЦЛС была синтезирована водорастворимая соль, в которой катионом является аминокислота — L-лизин, а анионами — смесь флавоновых глюкуронидов (далее флавоноидов).

В основу анализа положен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Метод позволяет не только разделять сложные смеси, но и получать некоторую информацию об их компонентах без выделения индивидуальных соединений.

Экспериментальная часть

Разделение флавоноидов проводится, как правило, на обращенных фазах при элюировании смесями ацетонитрил—вода или метанол—вода с небольшим содержанием фосфорной или уксусной кислоты [6–8]. Эти подвижные фазы удобны для разделения сложных смесей как флавоноидов, так и их гликозидов в условиях изократического и градиентного элюирования и допускают использование УФ-детекторов. При выборе условий хроматографирования испытывались различные подвижные фазы состава ацетонитрилфосфорная кислота—вода, метанолфосфорная кислота—вода, ацетонитрилуксусная кислота—вода. Ни на одной из вышеперечисленных подвижных фаз при градиентном элюировании на приборе типа Милихром не было достигнуто приемлемого разделения флавоноидов. Установлено, что наибольшей селективностью по отношению к разделяемым компонентам обладала подвижная фаза метанол—уксусная кислота—вода при элюировании в градиентном режиме с изменением концентрации метанола от 30 до 60 об.%.

Известно, что растворы флавоноидов имеют интенсивное поглощение в УФ-области спектра с максимумом при 320–380 нм (первая полоса поглощения) и 240–280 нм (вторая полоса поглощения) [1, 4]. Нами было установлено, что УФ-спектр поглощения взятой для исследования фракции, содержащей смесь флавоноидов из наземной части шлемника байкальского, имеет максимумы при 270 ± 5 нм и 330 ± 5 нм. Аналогичный спектр поглощения имеет и L-лизиновая соль смеси этих же флавоноидов.

Измерения проводились на хроматографе “Милихром-4” с УФ-детектором. Спектры светопоглощения измерялись на спектрофотометре СФ-56.

Используемые в работе спирт метиловый, спирт этиловый ректифицированный, диметилформамид, уксусная кислота и фосфорная кислота — фармакопейного достоинства [3].

Ацетонитрил для ВЭЖХ соответствует ТУ 88-0205-091-002-94.

Хроматографирование испытуемых растворов проводили в следующих условиях: колонка 1х150 мм, заполненная сорбентом Силасорб сфер. С8, зернением 10 мкм (фирма Элсико, Россия); скорость подачи ПФ — 30 мкл/мин.; температура колонки 250С; детектирование при длине волны — 270 нм; масштаб регистрации — 0,5 единиц оптической плотности; время интегрирования сигнала — 1,0 сек.; элюирование ступенчатое: подвижная фаза (ПФ) № 1 — 600 мкл, ПФ № 2 — 500 мкл, ПФ № 3 — 900 мкл, ПФ № 4 — 500 мкл; — подвижная фаза № 1: метанол—уксусная кислота—вода (30:0,1:69,9);
№ 2: метанол — уксусная кислота — вода (40:0,1:59,9);
№ 3: метанол — уксусная кислота — вода (50:0,1:49,9);
№ 4: метанол — уксусная кислота — вода (60:0,1:39,9)

Для приготовления испытуемого раствора навеску препарата 0,01 г помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в 3 мл диметилформамида, доводили объем раствора спиртом этиловым до метки и перемешивали.

В хроматографическую колонку вводили 5 мкл.

Раствор L-лизиновой соли смеси флавоноидов готовили следующим образом: 0,01 г препарата помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в 20 мл воды, доводили объем раствора водой до метки и перемешивали.

В хроматографическую колонку вводилась проба объемом 5 мкл.

Результаты исследований

В результате проведенной работы было достигнуто разделение хроматографических зон 8 флавоноидов, входивших в изученную нами сумму флавоноидов. Пять из них было идентифицировано. Хроматограмма раствора, содержащего смесь флавоноидов, представлена на рис. 2 (рисунок приведен в печатном варианте статьи). Аналогичная хроматограмма наблюдалась и для соли этих же флавоноидов с L-лизином.

Было также определено процентное соотношение флавоноидов в предложенной фракции (таблица 1).

Таблица 1. Флавоноидный состав фракции, полученной из надземной части шлемника байкальского и его L-лизиновой соли, в процентах
Флавоноид Содержание в смеси флавоноидов, % Содержание, в соли L-лизин смесь флавоноидов, %
1 2 3
Лютеолин - глюкуронид 4.2 4.1
Скутеллярин - глюкуронид 25.8 25.4
Алигенин - глюкуронид 17.2 17.4
Байкалеин - глюкуронид 7.3 7.2
Хризин - глюкуронид 36.9 37.5
Другие глюкурониды (сумма) 8.6 8.4
Сумма глюкуронидов 100.0 100.0

Обсуждение результатов

Из таблицы 1 видно, что процентное соотношение состава флавоноидов остается таким же и после получения соли с аминокислотой. Отличие в содержании отдельных компонентов в смеси до получения соли и после этого составляет не более 2,5%, что не превышает относительное стандартное отклонение при количественном определении методом ВЭЖХ. Учитывая этот факт, а также то, что при равных концентрациях, вводимых в хроматографическую колонку препаратов, площади полученных хроматографических зон отличаются (для смеси флавоноидов они несколько больше, чем для соли L-лизина с теми же флавоноидами), можно сделать вывод, что реакция L-лизина с флавоноидами прошла в эквивалентных соотношениях, причем, учитывая технологию получения соли, со всеми флавоноидами одновременно.

Из сопоставления времен удерживания флавоноидов с их структурными формулами видно, что с увелечением степени гидроксилирования флавоновых глюкуронидов время удерживания веществ уменьшается (таблица 2). Причем при равных количествах гидрокси-групп меньшим временем удерживания обладают те флавоноиды, у которых ОН-группы находятся в В-кольце флавона. Примером этого могут служить пары флавоноидов: лютеолин-глюкуронид/скутеллярин-глюкуронид и апигенин-глюкуронид/байкалеин-глюкуронид.

Таблица 2. Сравнительная таблица структурных формул флавоновых глюкуронидов, полученных из фракции надземной части шлемника байкальского, и время их удержания
Название Структура Время выхода, мин.
1 2 3
Лютеолин - глюкуронид

Лютеолин - глюкуронид, структура

21.4
Скутеллярин - глюкуронид

Скутеллярин - глюкуронид, структура

29.3
Алигенин - глюкуронид

Алигенин - глюкуронид, структура

38.3
Байкалеин - глюкуронид

Байкалеин - глюкуронид, структура

42.8
Хризин - глюкуронид

Хризин - глюкуронид, структура

58.6

Выводы

  1. Разработан метод анализа суммы флавоновых глюкуронидов надземной части шлемника байкальского.
  2. Впервые количественно оценен флавоноидный состав надземной части шлемника байкальского по отдельным компонентам.
  3. Рассмотрена зависимость времени удерживания флавоновых глюкуронидов в зависимости от их строения.
  4. Метод позволяет проводить анализ как суммы флавоновых глюкуронидов, так и суммы глюкуронидов в виде водорастворимых солей с L-лизином.

Литература

  1. Георгиевский В. П., Казаринов Н. А., Каррыев М. О., Физико-химические методы анализа биологически активных веществ растительного происхождения.— Ашхабад: “Ылым”.— 1976.— 240 с.
  2. Гольдберг Е. Д., Дыгай А. М., Литвиненко В. И., Попова Т. П., Суслов Н. И. Шлемник байкальский. Фитохимия и фармакологические свойства.— Томск: Изд-во Томс. ун-та.— 1994.— 223 с.
  3. Государственная фармакопея СССР, ХI изд. вып. 2.— с. 103–133.
  4. Кемертелидзе Э. П., Георгиевский В. П., Физико-химические методы анализа некоторых биологически активных веществ растительного происхождения.— Тбилиси: Мицениереба.— 1976.— 224 с.
  5. Куцык А. В., Середа А. В., Попова Т. П., Рыбаченко А. И., Литвиненко В. И. Спектрофотометрическое определение флавоноидов в траве шлемника байкальского//Фармаком.— 1998.— № 2.— С. 18–20.
  6. Conde E., Cadahia E., Garcia-Vallejo. HPLC analysis of flavonoids and phenolic acids and aldehydes in Eucalyptus spp.//Chromatographia.— 1995.— Vol. 41.— № 11/12.— P. 657–660.
  7. Delgado C., Tomas-Barberan F. A., Talou T., Gaset A. Capillary Electrophoresis as an alternative to HPLC for determination of honey flavonoids//Chromatographia.— Vol. 38.— № 1/2.— P. 71–78.
  8. Rath G., Toure A., Nianga M., Wolfender J.l., Hostettmann K. Characterization of C-glycosylflavones from Dissotis rotundifolia by Liquid Chromatography-UV Diode Array Detection — Tandem Mass Spectrometry//Chromatographia.— 1995.— Vol. 41.— № 5/6.— P. 332–342.




© Провизор 1998–2017



Грипп у беременных и кормящих женщин
Актуально о профилактике, тактике и лечении

Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
















Крем от морщин
Возможен ли эффект?
Лечение миомы матки
Как отличить ангину от фарингита






Журнал СТОМАТОЛОГ



џндекс.Њетрика