|
В. Ф. Москаленко Биологические свойства и патогенный потенциал листерий, циркулирующих в УкраинеХарьковский институт
усовершенствования врачей Характеризуя биологические свойства штаммов листерий, циркулирующих в Украине, следует заметить, что частота их изоляции в значительной степени зависела от состава используемых питательных сред и условий культивирования. Так, в начальном периоде исследования (1990—94 гг.) в качестве плотной элективной среды для выделения листерий применяли мясопептонный агар с включением 0,02% теллурита калия, что позволяло успешно изолировать листерий вида L. monocytogenes. При исследовании 218 проб воды, почвы, пищевых продуктов и клинического материала выделены были в основном возбудители указанного вида, а показатель высеваемости составил 2,2%. В последующие годы, и в особенности во время катастрофы на Диканевских очистных сооружениях, в период ликвидации последствий аварии и до нынешнего времени в качестве питательных сред использовали рекомендованные ВОЗ элективные среды ЛНЭЛА и СОБФА, что позволило показатель высеваемости повысить до 7,8% (Р < 0,05), при этом в основном за счет листерий видов L. ivanovii, L. seeligeri, L. innocua, L. welshimeri. Определением удельного веса различных видов листерий подтверждено доминирующее положение L. monocytogenes (78,4% в объектах окружающей среды и 78,6% в клиническом материале), L. ivanovii выделены в 7,5% из объектов окружающей среды и в 21,6% проб клинического материала, что достоверно (Р < 0,05) свидетельствует об этиологической их роли в возникновении заболеваний людей листериозом. Удельный вес L. seeligeri, L. welshimeri и L. innocua соответственно 7,6—1,8—3,7%. Изучены культурально-биологические и ферментативные свойства 116 штаммов листерий различных видов, выделенных в Украине и депонированных в музее ХНИИМИ им. И. И. Мечникова. Также в музее института депонированы 8 штаммов листерий различных видов, изолированных не территории Бельгии доктором P. Andre (Center de Reference des Listeria, Departament Microbiologie, Section Bacteriologie, Institut d’Hygiene et d’Epideiniologie, Brussel), которые использованы в нашей работе в качестве штаммов для сравнения. Колонии листерий отбирали на плотных элективных питательных средах с помощью стереоскопического микроскопа. Указанный простой и весьма доступный метод позволял четко дифференцировать колонии листерий от колоний других микроорганизмов (энтеробактерий, коринебактерий, гноеродных кокков). Колонии листерий на плотной питательной среде выглядят мелкими, чаще изолированными, с пышным ростом вверх, края их круто поднимаются, верхушка колонии несколько заостренная или округлая (при 2—3-х дневном росте), поверхность шероховатая с белым искрящимся и голубоватым оттенком, иногда имеющая вид граней или снежинок, цвет массы колоний серый или нежно-зеленоватый. На основании исследования более 600 проб материала нами подтверждена целесообразность использования для первичного выделения бактерий рода Listeria питательной среды ЛИЭАЛ (литий-налидиксовая кислота-глюкоза-элективный агар), оценка качества которой производилась по параметрах всхожести, уровня ингибиции, скорости роста и стабильности физико-химических показателей. При высеве на указанную питательную среду воды и почвы (предварительно простерилизованных и в последующем искусственно обсемененных 10 КОЕ листерий) всхожесть в опытах: с десятикратной повторностью составила до 68% (на среде с теллуритом калия — 18—26%), скорость роста — 36—48 часов, показатель ингибиции сопутствую–щей микрофлоры (в опытах с искусственной контаминацией) в отношении энтеробактерии, гноеродных кокков — не ниже 104. Среда достаточно стабильна по физико-химическим показателям и обеспечивала устойчивость биологических свойств листерий (характер роста, морфология микробов, биохимические свойства, серологические признаки, фаголизабильность и др.) на протяжении более, чем 10 пассажей (срок наблюдения). С целью среды обогащения при первичном выделении листерий из объектов внешней среды во время массового обследования в период аварии на Диканевских очистных сооружениях и ликвидации ее последствий использована среда СОБФЛ (жидкий прототип среды ЛНЭАЛ) в собственной модификации. На основе мясо-пептонного бульона с добавлением хлорного лития, налидиксовой кислоты и глюкозы в стандартном составе готовили среду СОБФЛ, в которую в последующем включали оригинальный антисептик декаметоксин 0,001% и многоатомный спирт глицерин (0,05%), что позволило ингибировать рост грибной флоры, которой изобилует почва, вода и т. д. Указанная питательная среда позволяла накопить в 1 мл до 8,6 + 1,8 млрд клеток (при искусственной контаминации почвы, воды и др.) в течение суток, показатель ингибиции составил 104—105. Для выделения L-форм листерий использовали элективные питательные среды ЛНЭАЛ и СОБФЛ также в авторской модификации, которая заключалась в дополнительном включении в состав их ингредиентов хлористого натрия (25%) и лошадиной сыворотки (5%). Изолированные штаммы листерий при температуре + 20° в 97,4% случаев обладали подвижностью, что позволило нам использовать указанный феномен в качестве критерия для дифференциации листерий от коринебактерий (методические рекомендации «Дифференциальная микробиологическая диагностика заболеваний, вызванных листериями и патогенными коринебактериями», Харьков, 1992) и возбудителей рожи свиней. Подвижность листерий изучали рутинными методами висячей (или раздавленной) капли или путем укола в полужидкую питательную среду. В случае использования последнего бактерии рода Listeria, по типу дыхания относящиеся в большей степени к аэробам и в меньшей — к факультативным анаэробам, формируют характерный «зонтик» роста на глубине не более 3—4 мм от поверхности. Следует обратить внимание (что весьма важно для практических бактериологов) на выраженную подвижность листерий только в режимах, культивирования + 20 — + 25°С, в то время как при обычно используемых в практике микробиологических лабораторий режимов +37+-5°С подвижность листерий обнаруживается весьма редко. Ферментативную активность изолированных в Украине и Бельгии листерий иллюстрируют сведения таблицы 1, из которых следует способность их к выраженной ферментации каталазы, глюкозы и мальтозы. Штаммы Listeria spp. не расщепляют маннит, рафинозу, инулин, мочевину, не редуцируют нитраты в нитриты, не образуют индол и сероводород, не утилизируют уреазу. Штаммы L. seeligeri, L. ivanovii и L. welshimeri, в отличие от штаммов L. monocytogenes и L. innocua не ферментируют ксилозу. По отношению к лактозе (учет производили к концу вторых суток культивирования) отмечено четкое различие штаммов, циркулирующих в Украине и Бельгии. Все бельгийские штаммы оказались лактозоположительными, в то время как среди украинских изолятов 86,4% (Р < 0,05) — лактозоотрицательные. Сахарозу расцепляли в 72,0% случаев L. ivanovii и L. L. innocua, L. seeligeri и L. welshimeri не ферментировали сахарозу, а среди L. monocytogenes сахарозоположительными оказались 12,8% штаммов. Изученные культуры листерий были гетерогенны в отношении рамнозы, салицина и дульцита. Большинство L. monocytogenes утилизировали рамнозу и салицин, дульцит расщепляли 11,6% культур. L. innocua ферментировали рамнозу, L. seeligeri — салицин, L. welshimer — дульцит. Указанное является весьма важным для расширения тестов внутриродовой дифференциации листерий.
Примечание: «+» - тест положительный в течение культивирования до 2-х суток, «—» - тест отрицательный при условии культивирования в течение 7 суток; «х» характерная вариабельность теста По антигенной структуре изученные культуры L. monocytogenes в 47,8% случаев отнесены к серотипу 1/2а, серотины 1/2b, 1/2с, 4 b встречались соответственно в 9,0—9,4 и 9,1%, серотип 4а — в 4,6%. Более чем в 20% случаев штаммы, изолированные в Украине, и более 35% культур листерий, выделенных в бассейне р. Северский Донец в период после аварии на Диканевке, не типировались агглютинирующими сыворотками международного набора. Выполненные исследования подтвердили антигенное различие штаммов, циркулирующих на различных географических территориях. Так, в США преобладают листерии серотипов 4а, 4b, 4аb, 4с, в Европе — 1/2а, 1/2b, 1/2с. Оценивая весьма высоко метод серотипирования листерий прежде всего для целей эпидемиологического маркирования, приходится лишь сожалеть, что в Украине по причине недостаточности наблюдений (целенаправленно не изучаются листерии в различных географических зонах, не определяются и не накапливаются О- и Н-антигены) еще не создана национальная коллекция штаммов листерий. Пока доступными для практических микробиологических лабораторий Украины являются лишь агглютинирующие сыворотки І и II серогрупп Алматинского биокомбината. Подразделение штаммов листерий лишь на два серотипа явно неадекватна общепринятой в мире классификации Н. Seeliger и L, Rocourt, дает низкодискриминантные результаты, не позволяет изучить стабильность серотипов в ходе лабораторного исследования и при длительном хранении. Использование указанных сывороток не позволяет типировать неревертирующие L-формы листерий. Выполненной нами работой положено начало создания национальной коллекции листерий, активной ревизии О- и Н-антигенной формулы циркулирующих в Украине штаммов, накапливанию серовариантов для начала изготовления коммерческих агглютинирующих листериозных сывороток. Вопросы фаготипирования листерий отражены только в зарубежной литературе (Locssner N., 1991; Bille L., 1992). Лучшая из зарубежных тест-систем Датская (Gerner-Smidt P. et аl., 1992) включает два набора фагов (12 фагов для L. monocуtogenes серотипа I и 14 фагов для типирования серотипа 4) и позволила за период ее использования (1992—1995 гг.) выделить ряд закономерностей в распределении культур листерий по фаголизабельности, а именно: существует видовая и серотиповая фагоспецифичность; прослеживается взаимосвязь между L. monocytogenes определенных фаговаров и их географической принадлежностью; не всегда отмечается четкая корреляция между фаго-, серо- и биотипами, рестрикционными профилями ДНК и данными изоэнзимного анализа типируемых культур бактерии рода Listeria; общепринятая международная схема типирования листерий несовершенна. Нами с целью фаготипирования 122 штаммов листерий использован набор бактериофагов производства экспериментального завода «Покровветбиопрепарат» Российского НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, включающий монофаги L 2А и L 4А, Чувствительными к ним оказались 57,4%, из них 48 культур типировались фагом L2a, 20 штаммов — фагом L 4а и 8 культур лизировались обеими фагами. Не проявляли чувствительности к указанным фагам L. innocua, L. seeligreri, L. ivanovii и L. welshimeri. Результаты фаготипирования использованы для более четкой идентификации и биологической характеристики культур листерий, однако для проведения эпидемиологического анализа и сопоставления культур, выделенных из различных объектов окружающей среды и от больных, материала сказалось недостаточно и полученные сведения сказались малоинформативными. Из оказанного также следует, что используемые в Украине и на территории СНГ наборы листериозных бактериофагов не позволяют целенаправленно применить их для решения задач эпидемиологического плана. Имеется настоятельная необходимость конструирования национальных наборов бактериофагов для типирования листерий, в особенности практически не типируемых сегодня, но весьма активно циркулирующих в Украине L. innocua, L. seeligeri, L. ivanovii и L. welshimeri. У 112 штаммов листерий определены некоторые признаки патогенности (табл. 2). Способностью продуцировать гемолизины обладали все изученные штаммы L. monocytogeneses, L. ivanovi и L. seeligeri. Не отмечено видовой чувствительности к гемолизинам листерий эритроцитов человека, барана, кролика, хотя при использовании последних зоны гемолиза обнаруживавшись особенно четко (у L. ivanovii в отличие от других листерий зона гемолиза имела двойной ореол с просветлением питательной среды на всю глубину).
Примечание: «—» — активностью штаммы не обладают L. monocytogenes в 76,2% обладают антилизоцимной активностью, в 44% продуцировали бактериоцины, в 92% оказались вирулентными для белых мышей, в 91% вызывали кератоконьюнктивит у кроликов, в 83,2% обуславливали некроз кожи морских свинок. Выделенные из листерий бактериоцины (листериоцины) не лизировали колонии энтеробактерий и гноеродных кокков, в то же время одна треть из них в опытах отсроченного антагонизма ингибировали рост С. xerosis. Анализ корреляции изученных свойств патогенности с использованием коэффициента ассоциации Пирсона позволил у клинических штаммов листерий по признакам гемолиза, вирулентности для мышей-сосунков, положительных кератоконъюнктивальной и дермонекротической проб определить его на уровне на ниже Га-0,81 со степенью достоверности (х2 > х25) с показателем значимости а — 0,5%. 38 культур L. monocytogenes, выделенных из окружающей среды в период ликвидации аварии на Диканевских очистных сооружениях на территории Харьковской, Донецкой и Луганской областей, исследовали методом реотрикционного анализа ДНК с использованием эндонуклеаз Ара I Sma I в сочетании с электрофорезом в пульсирующем поле. Известна хорошая воспроизводимость этого метода, рестрикофореграммы в электрическом пульсирующем поле с напряжением 0,5 В/с и интервалом пульсации в 1 сек. позволяют четко определить различия профилей рестрикционных фрагментов при использовании различных эндонуклеаз. В наших опытах ДНК L. monocytogenes давала однотипные стабильные результаты как при исследовании свежих культур листерий, так и в период их хранения до полугода, а также при изучении Rs- и R-субклонов диссациантов. Наиболее распространенным для культур листерий из 17 профилей оказался одиннадцатый (12,3%). Весьма важным, на наш взгляд, явилось наличие указанного признака у 7 клинических штаммов L. monocytogenes, выделенных в очаге группового заболевания на Южной железной дороге (Полтава, 1996). Установлены корреляционные связи между маркированием листерий методом рестрикционного анализа ДНК и другими типирующими системами (серотипирование, бактериоцинотипирование, факторы патогенности и др.), что позволяет оценить указанный метод молекулярно- эпидемиологического внутриродового и внутритипового типирования как весьма перспективный не только в плане научно-изыскательских исследований, но и для практического применения в эпидемиологических целях при условии наличия соответствующего оборудования, реактивов, теоретически и практически подготовленных специалистов. В соответствие методическим рекомендациям () изучена чувствительность штаммов листерий к противомикробным средствам (табл. 3) .
Методом двукратных серийных разведений в жидкой и плотной питательных средах определена чувствительность листерий к противомикробным средствам, для которых пока не изготовлены стандартные индикаторные диски. Результаты исследовании иллюстрирует таблица 4.
Результаты исследований позволяют заключить о высокой чувствительности циркулирующих в Украине и Бельгии листерий к производным хинолина и четвертичного аммония, что подтверждает перспективу применения в качестве лекарственных препаратов при лечении листериоза и борьбе с их носительством коммерческих средств — декаметоксина и этония, а также диктует необходимость разработки еще более эффективных противолистериозных препаратов на основе хиногликозидов и акридиниевых производных хинолина. Также весьма перспективными в качестве противолистериозных средств являются препараты эвкалипта, разработанные в лаборатории противомикробных средств ХНИИМИ им. И. И. Мечикова (автор В. Л. Надтока) — хлорофиллипт 0,1% спиртовой и 1% масляный раствор, эвкаван, хлороксицелл. По результатам чувствительности листерий к антибиотикам произведена попытка их типирования. При этом показано, что наиболее информативным (дискриминантность не ниже 6,4%) для маркирования по спектру антибиотикорезистентности оказалась чувствительность листерий к канамицину, оксациллину, полимиксину, стрептомицину, цефалексину. В отношении указанных антибиотиков L. monocytogenes распределены на 15 типов, L. ivanovii и L. seeligeri — на 4 типа, L. innocua и L. welshimeri — на 3 типа. Клинические штаммы листерий оказались сравнительно более устойчивыми к антибиотикам и чаще полирезистентными к ним в сравнении с штаммами, изолированными из объектов внешней среды. Следует отметить высокую воспроизводимость типирования листерий по отношению к различным антибиотикам, а также хлорофиллипту, декаметоксину и этонию, метод доступен практическим лабораториям, не требует серьезных материальных затрат, А с учетом стойкости феномена чувствительности/устойчивости у листерий (культивирование и хранение в течение полугода в столбике 0,7% МПА под вазелиновым маслом не изменяли спектр чувствительности к противомикробным средствам как исходных штаммов, так и субклонов Rs~ и R-дис-социантов) указанный метод маркирования вполне может быть использован в эпидемиологическом анализе при расшифровке вспышек листериоза или других заболеваний неясной этиологии, сходных с ним по клиническим проявлениям. Таким образом, нашими исследованиями установлена весьма активная циркуляция бактерий рода Listeria в различных географических зонах Украины, подтвержден широкий ареал их распространения в объектах окружающей среды (вода открытых водоемов и шахтных колодцев, канализационные стоки, почва). Отмечена высокая потенциальная значимость продуктов питания, пищевого сырья, холодильного и торгового оборудования в качестве факторов передачи инфекционного начала. У больных с инфекционным мононуклеозом, ангинами, менингитом, сепсисом, клинической картиной острого кишечного заболевания невыясненной этиологии в 11,1%—5,4%—7,1%—5,7%—3,1% соответственно изолированы листерии, что не исключает их роли в развитии указанных патологических процессов. Изучение биологических свойств большого массива циркулирующих в Украине листерий позволило охарактеризовать их по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам, факторам патогенности, фаголизабельности, бактериоциногенности, рестрикционным показателям ДНК, чувствительности к противомикробным средствам. Отмечено существенное различие (по отношению к лактозе) штаммов листерий, изолированных в Украине и Бельгии. Напряженная ситуация в плане возможной эпидемии, кишечных и внутрибольничных инфекций, в первую очередь, во время экологической катастрофы на Диканевских очистных сооружениях и в период ликвидации ее последствий, подтвердила актуальность выполненных в 1990—1995 гг. наших исследований по проблеме листериоза и продиктовала необходимость их интенсификации. Используя полученные новые данные по проблеме листерий, удалось взять под надежный контроль объекты внешней среды, лечебно-профилактические учреждения, пищевые и торговые предприятия, объекты общественного питания и др. как в г. Харькове, так и на территории бассейна р. Северский Донец и решить сугубо практическую задачу предупреждения развития эпидемии заболеваний листериозной этиологии. Результатом научных исследований по указанной проблеме явилось депонирование оригинальных штаммов листерий, изолированных в Украине, в Центре по контролю и предупреждению инфекционных заболеваний (Атланта, США) и в Центре по листериям Института гигиены и эпидемиологии (Брюссель, Бельгия) (таблицы 5, 6).
Изучены биологические свойства циркулирующих в Украине листерий, степень их патогенности, чувствительность к противомикробным средствам, произведена попытка внутривидового типирования листерий, накоплен фактический материал для создания национальной коллекции листериозных фагов, Н- и О-антигенов листерий, бактериоциногенных культур, а также штаммов листерий с охарактеризованной путем рестрикционного анализа нуклеиновой кислотой. Дана оценка питательным средам, используемым для изоляции, культивирования и сохранения листерий, модифицированы элективные питательные среды — ЛНЭАЛ, в том числе ЛИЗАЛ для L-форм листерий, СОБФЛ (для накопления листерий в пробах воды, почвы, продуктов питания и др.). Завершается работа по созданию Украинского государственного стандарта «Молоко и молочные продукты. Методы определения Listeria», подготовлены и внедрены в практических лабораториях Украины методические рекомендации: «Дифференциальная микробиологическая диагностика заболеваний, вызванных листериями и патогенными коринебактериями» (Харьков, 1992); «О порядке проведения лабораторных исследований на листериоз в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых токсикоинфекциях» (Харьков, 1995); «Чувствительность листерий к хлорофиллипту» (Харьков, 1997). Материалы выполненных исследований послужили основанием для приказа № 133 от 19 июля 1995 г. по Министерству здравоохранения Украины, в котором листериоз отнесен к особо опасным заболеваниям, предусмотрены обязательная регистрация и эпидемиологическое расследование случаев листериоза.
© Провизор 1998–2022
|
Грипп. Прививка от гриппа
Нужна ли вакцинация?
Как и чем лечить кашель?
Безрецептурные лекарства при сухом и влажном кашле Устойчивость микробов к антибиотикам →
Помогает ли одежда из шелка лечить экзему?
Что лучше развивает ребёнка — книжки с картинками или с текстом? О безопасности автокресел для детей в возрасте от 4 до 12 лет
Аллергический ринит
Забеременеть в 40 Лечение бесплодия. Обзор существующих вариантов Аденома простаты. Как и чем лечить ? |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|